Visualizzazione di un plesso coroideo cerebrale di topo mediante microscopia elettronica a scansione

Abstract

Fonte: Van Wonterghem, E., et al. Microdissezione e microscopia elettronica a scansione a montaggio intero Visualizzazione del plesso coroideo di topo. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video dimostra la preparazione e l'imaging del tessuto del plesso coroideo da un cervello di topo utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM). Il processo include la fissazione dei tessuti, la disidratazione e il rivestimento con uno strato di platino conduttivo per stabilizzare e preparare il campione per l'imaging. Il SEM acquisisce immagini dettagliate di cellule epiteliali con microvilli, fornendo informazioni sulle caratteristiche strutturali del tessuto.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Analisi morfologica del tessuto del plesso coroideo (CP) mediante microscopia elettronica a scansione (SEM)

ATTENZIONE: Le soluzioni tossiche vengono utilizzate nelle seguenti fasi di lavorazione. Si consiglia di eseguire la preparazione del campione in una cappa aspirante.

1. Eseguire la preparazione del campione per il SEM come descritto di seguito.
   1. Trasferire il CP isolato fresco in una soluzione di fissazione appena preparata contenente il 2% di paraformaldeide e il 2,5% di glutaraldeide in tampone Na-cacodilato 0,1 M (pH 7,4). Incubare per una notte a 4 °C.
      NOTA: Poiché il tessuto CP è molto fragile e sottile, il tessuto deve essere messo in piccoli cestelli per campioni (vedi Tabella dei materiali) per trasferirlo tra i tamponi. In questo modo, la struttura del tessuto sarà meglio preservata. Un fissativo a base di cacodilato viene utilizzato rispetto a uno a base di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), poiché il forte tampone cacodilato può contrastare il basso pH della glutaraldeide nel fissativo EM.
   2. Lavare il campione 3 volte per 5 minuti ciascuno con 3-5 mL di tampone Na-cacodilato 0,1 M (pH 7,4).
   3. Post-fissare i campioni in 3-5 mL di tetrossido di osmio al 2% in tampone Na-cacodilato 0,1 M per 30 minuti. Lavare i campioni 3 volte per 5 minuti ciascuno con 3-5 ml di acqua ultrapura.
   4. Disidratare i campioni in una serie di soluzioni ghiacciate con concentrazioni crescenti di etanolo (EtOH) (50%, 70%, 85%, 100%), per 15 minuti per soluzione di EtOH. Utilizzare un essiccatore a punto critico per asciugare correttamente il campione. NOTA: Il passaggio dalla fase liquida a quella gassosa influisce sulla tensione superficiale, causando danni alla struttura superficiale. La fase di essiccazione del punto critico consente di preservare la struttura superficiale.
   5. Posizionare con cura il campione su una montatura per campioni dotata di un adesivo in carbonio (vedi Tabella dei materiali).
   6. Rivestire i campioni con uno strato sottile (2-5 nm) di platino. Per fare ciò, montare una sorgente di platino in un sistema a vuoto tra due terminali elettrici ad alta corrente e riscaldare il platino alla sua temperatura di evaporazione. Sul campione viene depositato un sottile flusso di platino. NOTA: Oltre al platino, possono essere utilizzati anche oro o oro/palladio.
2. Visualizza i campioni CP con SEM (vedi Tabella dei materiali). La procedura di visualizzazione del tessuto CP tramite SEM è simile a quella di altri tipi di tessuti e dipende dal software e dagli strumenti utilizzati.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Supporti per campioni in alluminio	EM Sciences	75220
Tampone in cacodilato	EM Sciences	11652
Linguette adesive in carbonio -12 mm	EM Sciences	77825-12
Essiccatore per punti critici	Bal-Tec	CPD030
Traversa 540	Zeiss		Sistema SEM
Pinze	Fine Science Tools GmbH	91197-00
Glutaraldeide	EM Sciences	16220
Tetrossido di osmio	EM Sciences	19170
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Lonza	BE17-516F
Platinum	Quorum	Q150T ES	PBS senza Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ o rosso fenolo; filtrato sterile
Cestello per campioni in acciaio inossidabile	EM Sciences	70190-01