Imaging a fluorescenza della dinamica sinaptica del calcio in un modello in vitro di sclerosi laterale amiotrofica

Abstract

Fonte: Krishnamurthy, K. et al. Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche nei modelli di sclerosi laterale amiotrofica. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video mostra l'imaging del calcio in tempo reale per monitorare l'attività sinaptica nei neuroni mutanti della SLA che esprimono un biosensore di calcio geneticamente codificato. Delinea i passaggi per preparare i neuroni per l'imaging, stimolare la dinamica del calcio e registrare la fluorescenza per misurare i cambiamenti in tempo reale nei livelli di calcio intracellulare, che riflettono l'attività sinaptica neuronale.

Protocollo

1. Imaging a fluorescenza di transienti di calcio Gcamp6m

1. Trasfettare i neuroni corticali primari dei roditori coltivati su piastre con fondo di vetro da 35 mm con 500 ng di Gcamp6m.
   NOTA: Se lo si desidera, co-trasfettare i neuroni con un plasmide di interesse contenente un tag fluorescente nell'intervallo rosso o rosso lontano.
2. Incubare i neuroni con liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) a basso contenuto di cloruro di potassio (KCl) (Tabella 1) per 15 minuti, 48 ore dopo la trasfezione, quindi montare la capsula sulla piattaforma di imaging.
3. Visualizza la fluorescenza GCaMP6m utilizzando un filtro a isotiocianato di fluoresceina (FITC) (488 nm) e un obiettivo 20x o 40x.
4. Seleziona il campo di imaging e attiva una messa a fuoco perfetta. Quindi, scatta una singola immagine fissa con campo chiaro, FITC e canali marcatori di fluorescenza per contrassegnare i confini neuronali.
5. Avviare Esegui ora nel software di acquisizione. Eseguire la registrazione basale per 5 minuti e poi perfondere con aCSF contenente 50 mM KCL (Tabella 1).
   NOTA: L'obiettivo di questo imaging è misurare i transitori di calcio evocati. Se un neurone ha attività di attivazione basale e flussi di calcio durante il periodo di pre-stimolazione, non viene utilizzato nell'analisi dei dati. Invece, vengono utilizzate solo cellule con fluorescenza di fondo stabile. I periodi di post-stimolazione possono anche essere estesi a 60 minuti per i transitori di calcio, con o senza ulteriore perfusione continua di KCl elevata.
6. Salva l'esperimento e analizza i dati utilizzando il software confocale. L'esperimento può essere interrotto a questo punto e l'analisi può essere eseguita in un secondo momento.
   NOTA: Se le cellule non richiedono la trasfezione per l'espressione delle proteine di interesse, questo protocollo può essere eseguito in qualsiasi momento in vitro quando si cerca di esaminare i transienti del calcio. Dopo un test delle cellule di controllo per garantire la misurazione dei transitori del calcio, lo sperimentatore dovrebbe essere all'oscuro delle condizioni genetiche o farmacologiche di ogni piatto testato per ridurre al minimo le distorsioni.

2. Analisi delle immagini

1. Apri le immagini time-lapse con il software confocale.
2. Allinea le immagini in serie time-lapse con la serie di comandi: Immagine | Lavorazione | Allinea documento corrente. Selezionate Allinea al primo fotogramma.
3. Seleziona le regioni di interesse (ROI) lungo i neuriti utilizzando lo strumento di selezione ROI, un'icona a forma di fagiolo a destra della cornice dell'immagine. Inoltre, segnare una ROI che rappresenta l'intensità della fluorescenza di fondo.
   NOTA: Le ROI vengono selezionate scegliendo aree di punti nettamente separati lungo le tracce neuronali indicate dall'immagine fissa in campo chiaro. Per l'analisi vengono scelti almeno cinque ROI per neurone. Il ROI di sfondo viene scelto in una regione del campo visivo che non contiene neuriti.
4. Misura la fluorescenza grezza nel tempo per i ROI selezionati utilizzando la seguente serie di comandi: Misura | Misurazione del tempo.
   1. Avvia la funzione di misurazione nella parte superiore del pannello di misurazione del tempo. Vengono generati sia una rappresentazione grafica della fluorescenza grezza nel tempo che dati quantitativi.
      NOTA: Ogni punto dati rappresenta la fluorescenza grezza per quel ROI per il frame associato a quello specifico punto temporale misurato.
5. Esporta le intensità di fluorescenza grezze nel software per fogli di calcolo.

Tabella 1: Composizione dei tamponi del liquido cerebrospinale artificiale (aCSF).

Tampone KCL aCSF basso (pH da 7,40 a 7,45)
Concentrazione del reagente
HEPES	10 mM
NaCl	140 mM
KCl	5 mM
Glucosio	10 mM
CaCl2 2H2O	2
mM MgCl2 4H2O	1 mM
Tampone aCSF ad alto KCL (pH da 7,40 a 7,45)
Concentrazione	reagente
HEPES	10 mM
NaCl	95 mM
KCl	50
mM Glucosio	10 mM
CaCl2 2H2O	2
mM MgCl2 4H2O	1 mM

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