Microscopia olografica a due fotoni per studiare l'attività neurale e la connettività in un modello murino

Abstract

Fonte: Kato, D. et. al., Valutazione e manipolazione dell'attività neurale utilizzando la microscopia olografica a due fotoni. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video dimostra la tecnica di imaging a due fotoni combinata con l'optogenetica utilizzando la microscopia olografica. Utilizzando un modulatore di luce spaziale, questa tecnica consente una stimolazione neuronale precisa che esprime la proteina sensibile alla luce rossa e l'imaging del calcio con un fotodanno minimo. Questo approccio fornisce informazioni sulla connettività funzionale e sull'organizzazione delle reti neurali.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Impianto della piastra della testa (Figura 1A)

1. Somministrare l'anestetico (una miscela di 74 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina) per via intraperitoneale per anestetizzare il topo. Controllare frequentemente lo stato anestetico del mouse valutando i riflessi del pedale.
2. Dopo l'anestesia, posizionare il topo in uno strumento stereotassico. Applicare un unguento per gli occhi (vedi Tabella dei materiali) per evitare che la cornea si secchi quando viene impiantata la placca per la testa.
3. Radere l'area chirurgica e disinfettare la pelle con tre cicli alternati di scrub a base di iodio povidone o clorexidina seguiti da salviettine imbevute di alcol al 70%. Esporre accuratamente il cranio e pulirlo con tamponi di cotone.
   NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati e tutte le procedure devono essere eseguite di conseguenza. Eventuali detriti rimanenti (ad es. capelli o sangue secco) provocano reazioni infiammatorie. Pertanto, eventuali detriti devono essere rimossi sotto uno stereoscopio utilizzando tamponi di cotone inumiditi con acqua sterile o alcol al 70%.
4. Usa le coordinate stereotassiche - anteriore e posteriore = 0,5 mm, mediale e laterale = 1,5 mm da bregma - per trovare il centro della craniotomia ed etichettarlo con un pennarello.
5. Posiziona una piastra per la testa su misura al centro del cranio. Successivamente, applica il cemento dentale (vedi Tabella dei materiali) per fissarlo saldamente al cranio. Applicare una leggera pressione fino a quando la piastra della testa non entra in contatto con la parte anteriore e posteriore del cranio.
   NOTA: Questo passaggio richiede circa 20 minuti per essere completato ed è fondamentale per ridurre gli artefatti di movimento nel cervello durante l'imaging a due fotoni. Le dimensioni della piastra di testa sono 20 mm × 40 mm × 1 mm con un'apertura a forma di piastra di partenza con un bordo lungo 15 mm, due lati adiacenti lunghi 3 mm e i restanti due lati lunghi 10 mm.
6. Mescola insieme un cemento resinoso adesivo dentale a base acrilica come segue: mezzo cucchiaio di polvere, tre gocce di liquido e una goccia di catalizzatore (vedi Tabella dei materiali). Per evitare l'essiccazione, applicare questo cemento resinoso adesivo dentale misto sulla superficie intatta del cranio del topo con la piastra della testa.
7. Metti il topo in una gabbia calda fino a quando non si sarà ripreso dall'anestesia. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.

2. Chirurgia e iniezione di virus adeno-associati (AAV) (Figura 1B)

1. Eseguire la craniotomia o l'iniezione virale senza rimuovere il cemento resinoso adesivo dentale dal cranio 1 giorno dopo l'impianto della placca testale.
   NOTA: Somministrare l'anestesia (una miscela di 74 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina) per via intraperitoneale al topo durante questa procedura.
2. Per evitare l'edema cerebrale, somministrare desametasone fosfato sodico (1,32 mg/kg) per via intraperitoneale 1 ora prima dell'intervento chirurgico.
3. Anestetizzare il topo con la piastra della testa con anestesia con isoflurano all'1% utilizzando un vaporizzatore (sistema di somministrazione dell'anestesia) mantenendo la temperatura corporea con un termoforo. Applicare un unguento per gli occhi per prevenire l'essiccazione della cornea.
4. Sotto uno stereoscopio, eseguire una craniotomia circolare di circa 2 mm di diametro utilizzando un trapano dentale. Per ridurre i danni cerebrali, azionare il trapano dentale con cautela con un leggero movimento costante e una leggera pressione verso il basso.
5. Rimuovere i frammenti ossei più volte utilizzando un sistema di aspirazione. Dopo aver rimosso i frammenti ossei, utilizzare una soluzione di liquido spinale artificiale (ACSF) per rimuovere e lavare eventuali detriti rimasti sulla superficie del cervello. Ripetere questa procedura di pulizia più volte per sopprimere le reazioni infiammatorie.
   NOTA: La soluzione ACSF (140 mM di cloruro di sodio, NaCl, 2,5 mM di cloruro di potassio, KCl, 5 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanesolfonico, HEPES, 2,0 mM di cloruro di calcio, CaCl₂ e 1,0 mM di cloruro di magnesio, MgCl₂) è stata conservata a 4 °C per 1 mese dopo che il reagente è stato sciolto e filtrato (dimensione dei pori = 0,22 μm).
6. Utilizzando un sistema di iniezione a pressione (vedi Tabella dei materiali), impostare la pressione appropriata (circa 10 libbre per pollice quadrato (PSI) in impulsi con una durata di 4 ms) per iniettare 500 nL di soluzione AAV attraverso un capillare di vetro con un diametro della punta di 10-20 μm (preparato con un estrattore per micropipette) per 10 minuti.
7. Determinare se la soluzione AAV viene somministrata al cervello da verificare se il livello della soluzione AAV nel capillare di vetro diminuisce gradualmente.
8. Lasciare il capillare di vetro in posizione per altri 10 minuti per evitare il riflusso. Ripetere tre volte per somministrare un totale di 1,5 μL di soluzione di AAV nel cervello.
9. Per valutare e manipolare l'attività neurale nelle cellule piramidali di strato 2/3 (L2/3), iniettare una soluzione AAV (per l'imaging Ca²⁺: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE a 1,28 × 10¹⁴ genomi vettoriali/mL, diluito 1:1 in soluzione salina; per l'imaging Ca²⁺ con optogenetica: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE a 1,73 × 10¹⁴ genomi vettoriali/mL, diluito 1:1 in soluzione fisiologica) nell'area della zampa posteriore della corteccia somatosensoriale primaria di topi wild-type (S1, centrato a 0,5 mm posteriormente e 1,5 mm lateralmente dalla bregma, a 150 μm di profondità dalla superficie).
   NOTA: La soluzione AAV deve essere iniettata a 2-3 settimane e 1-2 settimane prima dell'imaging per l'espressione di jGCaMP8f e GCaMP6m-P2A-ChRmine, rispettivamente.
10. Dopo un'applicazione di agarosio a basso punto di fusione al 2% (p/v) sulla superficie cerebrale di S1 utilizzando una micropipetta, posizionare una finestra di vetro sopra la craniotomia con due occhiali di copertura. Fissare i due vetri di copertura (diametro piccolo 2,0 mm e diametro grande 4,5 mm; vedere Tabella dei materiali) con adesivo polimerizzabile a raggi ultravioletti (UV).
11. Premere il vetro di copertura contro l'agarosio mentre è ancora liquido; Questo impedisce la formazione di bolle d'aria nell'agarosio. Sigillare i bordi della finestra cranica con cemento resinoso dentale e adesivo (Figura 1C).
12. Rimuovere il mouse dallo strumento stereotassico e rimetterlo nella sua gabbia. Metti il topo in una gabbia calda e non tornare nella gabbia con altri animali fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia. Mantenere attentamente le condizioni sterili durante la chirurgia di sopravvivenza.
13. Per le prime 72 ore dopo l'intervento, controllare lo stato di salute del topo osservando il comportamento generale. In caso di anomalie nel comportamento generale, iniettare per via sottocutanea agenti antinfiammatori e analgesici.

3. Preparazione per il sistema di stimolazione o illuminazione olografica (Figura 2)

1. Calibrare il sistema di stimolazione olografica posizionando la superficie di un vetrino a fluorescenza rosso (substrato acrilico colato) sul piano del campione. Posizionare il microscopio in modalità di imaging dal vivo con una luce di eccitazione debole ed eseguire il file calibration_GUI.m. Controlla il riquadro dei parametri e fai clic sul pulsante Salva .
2. Fare clic sul pulsante Z Scan nel riquadro del passaggio 1. Genererà automaticamente tre punti casuali in tutti i 21 piani assiali, a 2 μm di distanza da ciascun piano.
3. Sposta la barra di scorrimento e controlla l'immagine dal vivo. Trova un piano perfetto in cui le macchie appaiono le più piccole e luminose, quindi fai clic sul pulsante Salva . In questo modo verrà generato automaticamente un fronte d'onda sferico di offset per l'ologramma digitale.
   NOTA: Se non riesci a trovare i punti di fluorescenza più luminosi, modifica i valori minimo e massimo dell'intervallo di scansione e riprova.
4. Fai clic sul pulsante Vai nel riquadro del passaggio 2, quindi fai clic su sei punti nel quadrato sinistro. Controlla l'immagine dal vivo. Se ci sono sei punti di fluorescenza distinguibili, digita i loro assi x e y nelle caselle di modifica e fai clic sul pulsante Salva . Questo genererà automaticamente coefficienti di trasformazione affine per coordinare la calibrazione tra la stimolazione olografica e il sistema di imaging.
   NOTA: Il numero della coppia di assi e il numero del punto cliccato devono corrispondere in ordine. Se non sei sicuro o se non ci sono macchie nell'immagine, riprova e genera un modello di punti unico o scegli un intervallo più piccolo attorno al centro del campo visivo (FOV).
5. Fare clic sul pulsante Scansione nel riquadro del passaggio 3. Genererà 441 ologrammi digitali per eseguire la scansione di un singolo punto attraverso il FOV in 21 × 21 passaggi.
   1. Innanzitutto, controlla le immagini mentre cambi i modelli nella casella di riepilogo. Quindi, regolare la potenza del laser per ottenere immagini spot all'interno della gamma dinamica del dispositivo di imaging (ad esempio, per evitare immagini eccessivamente sature).
   2. Successivamente, regolare l'intervallo di tempo nella casella di modifica; L'intervallo di tempo deve essere più di due volte l'intervallo di tempo di registrazione. Infine, mettere il dispositivo di imaging in modalità di registrazione e fare clic sul pulsante Riproduci . Al termine dell'esecuzione, nella finestra di comando verranno visualizzate le stringhe "visualizza OK". Interrompi la registrazione e impila le immagini sequenziali registrate utilizzando il metodo dell'intensità massima.
6. Fai clic su Genera WM nel riquadro del passaggio 4 e scegli un'immagine impilata dall'alto. Quindi chiudere la finestra calibration_GUI. Genererà automaticamente una mappa del peso per compensare l'intensità sbilanciata in ogni punto.
   NOTA: Per una descrizione più dettagliata, il codice MATLAB può essere scaricato da qui (https://github.com/ZenKG/SLM_control).

4. Ca²⁺ imaging utilizzando un sensore di immagine con illuminazione olografica (Figura 3)

1. Posizionare il topo iniettato con AAV con una piastra per la testa sotto il microscopio (Figura 1D).
   NOTA: Durante questa procedura, il topo è trattenuto nello stato di veglia, ma è in grado di sfuggire a stimoli scomodi.
2. Esegui l'imaging a due fotoni (modalità di scansione a punti) utilizzando un microscopio olografico e un laser Ti: zaffiro con blocco in modalità sintonizzato a 920 nm con un obiettivo 25x (vedi Tabella dei materiali).
3. Attiva il software di imaging commerciale (vedi Tabella dei materiali). Nella modalità di imaging dal vivo, regolare la tensione del rivelatore di immagini (vedere Tabella dei materiali) e la potenza del laser di imaging per ottimizzare la luminosità dei neuroni che esprimono jGCaMP8f. Cattura immagini dei neuroni che esprimono questa proteina.
   NOTA: L'intensità del laser di imaging (920 nm) è di 20-30 mW. Il FOV era di 512 μm × 512 μm a una profondità di 100-150 μm dalla superficie corticale.
4. Per illuminare neuroni specifici che esprimono jGCaMP8f con l'illuminazione olografica, eseguire il file di script SLMcontrol.m. Fai clic su Immagine di riferimento e scegli l'immagine acquisita sopra. Quindi, fai clic sul pulsante Spot per scegliere pixel specifici sui neuroni nell'immagine facendo clic continuo con il mouse (Figura 3A). Se la selezione è completa, premere il pulsante Invio sulla tastiera per finalizzarla.
   NOTA: L'ologramma digitale viene calcolato automaticamente e visualizzato sul modulatore di luce spaziale (SLM). Questo modello può anche essere rivisto facendo clic su una casella di riepilogo. La risoluzione spaziale di un singolo spot generato dall'SLM era di circa 1,2 μm lungo la direzione trasversale e ~8,3 μm lungo l'asse ottico. Abbiamo utilizzato un obiettivo ad alta apertura numerica (1,1) per ottenere una stimolazione olografica più localizzata.
5. Per rilevare l'attività neurale con un'alta risoluzione temporale utilizzando un sensore di immagine (vedere Tabella dei materiali), impostare il tempo di esposizione, l'area di imaging e il binning (Figura 3B) prima di eseguire l'acquisizione dell'immagine (Figura 3C).
   NOTA: L'intensità del laser di illuminazione olografica (920 nm) che stimola continuamente un neurone è di 2 mW, che è sufficiente per rilevare l'attività neurale. Ad esempio, per ottenere un frame rate di 100 Hz per l'imaging, il tempo di esposizione è di 9 ms, l'area di imaging è di 400 μm × 400 μm e il binning è di 4.
6. Dopo l'esperimento, riporta il topo nella sua gabbia di casa.

5. Imaging a due fotoni (modalità di scansione a punti) con optogenetica utilizzando un microscopio olografico (Figura 4)

1. Ripetere i passaggi 4.1 e 4.2.
2. Attivare il software di imaging commerciale (vedere Tabella dei materiali). Nella modalità di imaging dal vivo, regolare la tensione del rivelatore di immagini (vedere Tabella dei materiali) e la potenza del laser di imaging per ottimizzare la luminosità dei neuroni che esprimono GCaMP6m-P2A-ChRmine. Cattura immagini dei neuroni che esprimono queste proteine (Figura 1E).
3. Ripetere il passaggio 4.4.
4. Per studiare la connettività funzionale all'interno dei neuroni L2/3, utilizzare un SLM per generare pattern olografici di stimolazione optogenetica (ChRmine; 1.040 nm) e combinarlo con l'imaging Ca²⁺ a due fotoni (GCaMP6m; 920 nm, 512 × 512 pixel, 2 Hz o 30 Hz, zoom digitale 2x, modalità di scansione a punti; Figura 3D-H).
   1. Per questo protocollo, impostare l'intensità del laser di imaging a 920 nm, a 10-20 mW, e il FOV a 256 μm × 256 μm misurato a una profondità di 100-150 μm dalla superficie corticale. Impostare il tempo di permanenza dei pixel a 1,5 μs per 2 Hz o 100 ns per 30 Hz.
   2. Per vedere se un singolo stimolo olografico ha causato una risposta del calcio nei neuroni, utilizzare sia 2 Hz che 30 Hz come frame rate di imaging. Impostare l'intensità del laser di stimolazione olografica (1.040 nm) che stimola un singolo neurone a 10 mW, che è sufficiente per indurre l'attività neurale (Figura 3D).
      NOTA: La risoluzione spaziale di un singolo spot generato dall'SLM è di circa 1,2 μm lungo la direzione trasversale e ~8,3 μm lungo l'asse ottico. L'intervallo di volume accessibile in direzione laterale è di circa 500 μm × 500 μm e 100 μm in direzione assiale. Abbiamo inoltre confermato con l'imaging Ca²⁺ a 2 Hz o 30 Hz di frame rate che non solo un neurone, ma più neuroni possono essere stimolati olograficamente simultaneamente (Figura 3E).
5. Eseguire l'acquisizione delle immagini con il seguente protocollo: simultaneamente visualizzare la risposta Ca²⁺ a 920 nm con 10 stimoli olografici a 1.040 nm con intervalli di 8 s (0,125 Hz) per una durata di 50 ms dopo un periodo di base di 10 s.

Risultati

Figura 1: Cenni schematici della procedura sperimentale. (A) Fissaggio della piastra della testa al cranio. (B) Iniezione stereotassica di AAV nell'area della zampa posteriore della corteccia somatosensoriale primaria (...

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