Imaging del calcio in tempo reale di una corteccia prefrontale mediale di topo utilizzando un miniscopio

Abstract

Fonte: Thapa, R., et. al., Iniezione virale stereotassica e impianto di lenti con indice di gradiente per l'imaging del calcio In vivo. J. Vis. Exp. (2021)

Il video dimostra l'imaging del calcio in tempo reale utilizzando un miniscopio in un topo trasdotto, correlando l'attività neuronale con il comportamento.

Protocollo

Montaggio del miniscopio e imaging in vivo Ca²⁺ (Figura 1)

1. Montare il miniscopio alla sua base
   1. Anestetizzare brevemente il topo nella camera di induzione (5% di isoflurano e 1 L/min di portata di ossigeno). Posizionare il mouse su una superficie pulita del banco.
   2. Allentare la vite di bloccaggio con un piccolo cacciavite, rimuovere il cappuccio protettivo e pulire la superficie della lente GRIN (Gradient-index lens) con un batuffolo di cotone imbevuto di acetone.
   3. Avvolgere strettamente un nastro in PTFE (nastro di politetrafluoroetilene) attorno alla filettatura del miniscopio e fissare il miniscopio alla sua base sulla testa del mouse.
   4. Collegare il miniscopio al cavo (Figura 2K) e accendere il software NeuView.
   5. In NeuView, fare clic su Hardware, selezionare LED1 e fare clic sul pulsante Stream per visualizzare le immagini dal vivo (Figura 3A).
   6. Identificare il miglior piano focale regolando la posizione del miniscopio rispetto alla base, stringendolo leggermente o allentandolo con l'aiuto di una pinza smussata.
      NOTA: Il miglior piano focale viene determinato confrontando diverse posizioni possibili e selezionando quella con una chiara visualizzazione della maggior parte dei corpi cellulari.
   7. Serrare la vite di bloccaggio e riposizionare il mouse nella gabbia di casa.
   8. In NeuView, regolare la potenza della luce LED al livello ottimale. Fare clic sui pulsanti Cattura e quindi su Trigger per avviare la registrazione e premere Stop dopo 150 fotogrammi.
      NOTA: La potenza più bassa possibile determina il livello ottimale della potenza del LED per ottenere un'immagine sufficientemente luminosa. Lo scopo della registrazione di un breve video è quello di facilitare l'identificazione dello stesso piano focale in futuro per l'imaging ripetitivo.
   9. Scollegare il cavo dal miniscopio. Lasciare che il mouse si riprenda per almeno 30 minuti prima di iniziare l'esperimento.
      NOTA: Per proteggere il miniscopio, in genere, la bottiglia d'acqua e l'alimentatore di cibo a filo vengono rimossi durante questo breve periodo di tempo. Se il topo ha bisogno di rimanere nella sua gabbia domestica più a lungo, si consiglia di fornire gel dietetico disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) nella gabbia domestica.
2. Acquisizione dei dati per l'imaging del calcio in vivo
   NOTA: In vivo, l'imaging del calcio può essere condotto contemporaneamente insieme a qualsiasi test comportamentale desiderato dal ricercatore. A scopo dimostrativo, l'esempio qui è l'imaging in vivo del Ca²⁺ durante un test in campo aperto. Per raggiungere questo obiettivo, sono necessari due computer. Un computer è dotato di un software commerciale (vedi Tabella dei materiali) per controllare una telecamera per registrare automaticamente il comportamento del mouse. L'altro computer è dotato di NeuView per controllare il miniscopio e per registrare le immagini Ca²⁺.
   1. Attiva il software della telecamera di comportamento (vedi Tabella dei materiali) per visualizzare l'arena del comportamento del mouse attraverso una funzione Livestream. Regolare manualmente la messa a fuoco della fotocamera superiore (Figura 2L).
   2. Selezionare Trigger/Strobo e selezionare "Abilita/disabilita trigger" (Figura 3B). Fare clic sul pulsante Registra, utilizzare Sfoglia per selezionare la posizione in cui verranno salvate le registrazioni del comportamento e selezionare il formato immagine desiderato.
      NOTA: La funzione "Trigger Control" è abilitata per consentire l'attivazione della registrazione del comportamento da parte del software NeuView in modo che i frame di comportamento e i corrispondenti frame di imaging del calcio siano accoppiati temporalmente insieme. La registrazione del comportamento può essere salvata in qualsiasi formato desiderato. La registrazione del comportamento viene generalmente salvata in formato JPEG nella cartella designata.
   3. Avvicinare il mouse all'arena e collegare il miniscopio al cavo collegato al sistema di acquisizione dati (Figura 2L) (vedi Tabella dei materiali). Il mouse viene quindi posizionato al centro dell'arena.
   4. Con la funzione Livestream del software NeuView, regolare la potenza del LED per ottimizzare la luminosità dell'immagine del calcio.
      NOTA: Per l'imaging del calcio, la frequenza dei fotogrammi di registrazione è di 10 fotogrammi/s per impostazione predefinita.
   5. In NeuView, deseleziona LED1, fai clic su Acquisisci, quindi sui pulsanti Attiva per avviare la registrazione e premi Stop dopo 100 fotogrammi.
      NOTA: questo serve per registrare immagini di sfondo per circa 100 fotogrammi con luci LED spente.
   6. Nel software della fotocamera comportamentale, fare clic su Avvia registrazione (Figura 3C). In NeuView, selezionare LED1, fare clic su Acquisisci, quindi sui pulsanti di attivazione per avviare la registrazione. Premi Stop dopo 3000 fotogrammi.
      NOTA: Questo serve per registrare simultaneamente l'imaging del calcio e il comportamento. Il test in campo aperto dura 15 minuti, tipicamente suddiviso in tre sessioni di registrazione di 5 minuti ciascuna. Questo per evitare che il miniscopio si surriscaldi a causa dell'uso continuo.
   7. Salvare sia l'imaging del calcio che le registrazioni del comportamento nelle cartelle designate. Ripetere la registrazione per altre due sessioni mentre si registra lo sfondo prima di ogni sessione e salvare tutte le registrazioni nella cartella designata.

Risultati

Figura 1: Panoramica schematica della procedura sperimentale. (A) Iniezione stereotassica del virus nella mPFC (corteccia prefrontale mediale). (B) Impianto di lenti GRIN (lenti a indice di gradiente) nella m...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acetone	Sigma-Aldrich	179124-1L	GRIN lens cleaner
Software di ricodifica del comportamento (Point Grey FlyCap2)	Point Grey	Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C	Per registrare il comportamento
controller	NIDA/IRP	Componente del sistema di acquisizione delle immagini	progettato su misura
Cavo di trasmissione dati	NIDA/IRP	Componente del sistema di acquisizione delle immagini	progettato su misura
Lente GRIN	GRINTECH	NEM-100-25-10-860-S	Per l'impianto della lente GRIN
Base del miniscopio	Protolabs	Progettato su misura	Per il montaggio della base
Miniscopio braccio di supporto	NIDA/IRP	Progettato su misura	Per il montaggio della base
Cappuccio di protezione del miniscopio	Protolabs	Progettato su misura	Per proteggere il miniscopio
Controller motorizzato	Thorlabs	KMTS50E	Per il montaggio della base
NeuView	NIDA/IRP	https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0	Per l'imaging in vivo
Unguento oftalmico	Unguento veterinario Puralube	NDC 17033-211-38	oftalmico
in politetrafluoroetilene (PTFE)	TegaSeal Nastro in PTFE	A-A-58092	Per il fissaggio del miniScope alla base
Batuffolo di cotone sterile	Puritan	REF 806-WC	Per entrambi gli interventi chirurgici

Nastro