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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Configurazione del microscopio per l'imaging time-lapse
1. Determinazione delle impostazioni laser
1. Determinazione della lunghezza d'onda del laser da utilizzare. Utilizzare una lunghezza d'onda che sia il doppio della lunghezza d'onda di eccitazione del fluoroforo di interesse (ad es. lunghezza d'onda compresa tra 880 e 940 nm per la proteina fluorescente verde (GFP).
NOTA: Nel presente studio, l'impostazione della lunghezza d'onda per GFP era compresa tra 880 e 940 nm. Maggiore è la lunghezza d'onda, minore è la potenza di uscita del laser.
2. Determina la trasmissione laser. Un'alta percentuale di trasmissione laser ucciderà l'embrione, utilizzare il livello di trasmissione più basso (consigliato). Per gli studi time-lapse da 24 a 48 ore, come qui presentato, mantenere la trasmissione al di sotto del 5%.
3. Determina i sistemi di rilevamento del microscopio e assicurati che siano presenti i filtri corretti per il fluoroforo.
NOTA: Per i microscopi multi-fotone, ci sono più sistemi di rilevamento con varie sensibilità per la fluorescenza emessa. In generale, un sistema di rilevamento interno ha una sensibilità inferiore rispetto a un sistema di rilevamento esterno. Per le linee transgeniche con alti livelli di espressione di GFP, il sistema di rilevamento interno è adeguato. Per le linee transgeniche con bassi livelli di espressione di GFP o con altri fluorofori (ad esempio, proteina fluorescente rossa), può essere necessario un sistema di rilevamento esterno per mantenere la percentuale di trasmissione laser a un livello ragionevole. Indipendentemente dal sistema di rilevamento utilizzato, devono essere presenti i filtri corretti per il fluoroforo.
2. Regolazione delle impostazioni del software sul microscopio multi-fotone
1. Utilizzando l'obiettivo 5X, localizzare l'embrione. Sollevare manualmente il tavolino nella posizione più alta e utilizzare la messa a fuoco fine per posizionare l'embrione al centro della gamma del microscopio.
2. Abbassa manualmente il tavolino e cambia l'obiettivo 5X con l'obiettivo a immersione in acqua 25X (apertura numerica NA, 0.95). Solleva con cautela il tavolino per riportare l'embrione a fuoco.
3. Nel software, clicca sulla modalità "xyzt" per ottenere immagini multiple a intervalli di tempo (t) nel piano x-y su una profondità di "z". Usa l'epifluorescenza o la vista in campo chiaro per trovare la profondità di messa a fuoco nell'area di interesse, che delimiterà lo Z-stack.
1. Nel software, clicca sul pulsante "inizia"; per questi esperimenti, il bordo laterale dell'occhio era l'inizio della pila Z. Fare clic sul pulsante "fine"; la linea mediana dell'embrione era la fine della pila Z.
NOTA: La dimensione del passo era 0,3-0,6 μm e c'era un totale di ~200 passi per una dimensione della pila z da 60 a 120 μm).
4. Clicca sul menu per regolare il tempo di acquisizione e la frequenza di imaging.
Per il sistema attuale, ~200 passi richiedono circa 5 minuti per ogni acquisizione z-stack. Per un adeguato recupero del fluoroforo e la sopravvivenza dell'embrione, tenere conto di un rapporto di almeno 1:3 tra l'acquisizione z-stack (accensione del laser) e il tempo di recupero (spegnimento del laser).
NOTA: Ad esempio, gli z-stack vengono acquisiti ogni 20 minuti con 5 minuti di acquisizione z-stack e 15 minuti di recupero. Per questo protocollo, è possibile ottenere z-stack più grandi, ma aumenterebbe in modo appropriato il tempo tra le acquisizioni z-stack, con conseguente minor numero di immagini nel corso del time-lapse.
1. Con il tempo appropriato per il recupero dell'embrione, imposta il tempo tra gli z-stack nella finestra designata. Imposta la durata totale dell'esperimento nella finestra appropriata.
5. Regolazioni finali del software, del laser e dell'embrione.
1. Attiva l'impostazione dell'immagine dal vivo per apportare le regolazioni finali alle impostazioni del laser. Regola le barre di scorrimento della trasmissione laser, del guadagno e dell'offset all'interno del software per ottimizzare l'immagine fluorescente. Inoltre, regolare l'orientamento dell'embrione, se necessario, a seconda della durata dell'esperimento, della crescita prevista dell'embrione, ecc. Assicurati che l'area di interesse rimanga all'interno dell'inquadratura per tutta la durata dell'esperimento.
2. Spegni la sorgente di luce epifluorescente poiché non è più necessaria durante l'acquisizione time-lapse. Coprire il tavolino con la scatola di sicurezza laser (Figura 1I). Quando si utilizza il sistema di rilevamento interno, la scatola di sicurezza laser è sufficiente per la protezione contro la luce di fondo. Premere "start".
NOTA: Tuttavia, con sistemi di rilevamento esterni più sensibili, la scatola di sicurezza laser non blocca abbastanza luce di sfondo e sono necessari coperchi aggiuntivi per evitare l'interruzione dell'acquisizione dell'immagine.
2. Durante l'acquisizione time-lapse
1. Riempire la camera del bagno aperta con terreni embrionali time-lapse ogni 8-12 ore (almeno 2 volte al giorno) durante l'acquisizione time-lapse attraverso le porte scorrevoli sulla scatola di sicurezza laser (Figura 1I).
2. Prima di aprire le porte della cassetta di sicurezza laser, assicurarsi che il microscopio non stia acquisendo attivamente un'immagine.
NOTA: L'uso di riscaldatori e sistemi di mezzi di circolazione non è necessario per esperimenti di imaging time-lapse che durano da 24 a 48 ore. Infatti, le temperature sia dello stadio che dei riscaldatori in linea sono difficili da controllare e durante l'acquisizione dell'immagine l'embrione mostra un tasso di sviluppo adeguato a un intervallo di temperatura compreso tra 25 e 28 °C. Inoltre, i sistemi di circolazione dei fluidi tendono a traboccare e potenzialmente a danneggiare l'apparecchiatura. Pertanto, tutti gli embrioni vengono regolarmente messi in scena dopo l'acquisizione.
3. Elaborazione post-acquisizione
1. Nel software, fare clic sul menu "file" e scegliere "salva".
2. Apri il file nel software di elaborazione delle immagini (vedi la Tabella dei Materiali). Evidenzia la serie di immagini corretta. Nel software, selezionare il menu "Processo". Fare clic su Deconvoluzione 3D e "Applica" per deconvolgere ogni z-stack.
NOTA: Il file è grande; Pertanto, questo passaggio potrebbe richiedere molte ore.
3. Nel software, nel menu "Processo", fai clic su "proiezione massima". Fare clic su "Applica" per avviare la proiezione massima per generare 1 immagine per z-stack. Esportate ogni file proiettato massimo (1 immagine per z-stack) come tiff.
4. Importa singoli file tiff nel software di elaborazione video. Seleziona tutti i file tiff e trascinali nell'editor video. Regola la lunghezza di ogni immagine all'interno del video a 0,1 secondi. Esporta video come file mov o mp4.
