Visualizzazione dei modelli di proiezione assonale dei motoneuroni embrionali in Drosophila

1. Preparazione

1. Preparare 500 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con soluzione di t-Ottilfenossipolietossietanolo (PBT) aggiungendo 0,5 g di albumina sierica bovina (BSA) e 0,5 mL di t-Ottilfenossipolietossietanolo (vedere la Tabella dei materiali) a 500 mL di PBS 1X e agitando per almeno 30 minuti. Conservare a 4 °C. Utilizzare quando è relativamente fresco e conservare la soluzione in un flacone pulito.
2. Preparare 10 mL di paraformaldeide al 4% aggiungendo 2,5 mL di soluzione di paraformaldeide stock al 16% e 1 mL di 10x PBS a 6,5 mL di acqua deionizzata. Conservare a 4 °C e consumare entro una settimana.
   ATTENZIONE: Evitare il contatto della pelle con la soluzione di paraformaldeide perché è altamente tossica.
3. Produrre il substrato di 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-Gal) (10% p/v di X-Gal in dimetilsolfossido (DMSO)) sciogliendo 0,1 g di substrato di X-Gal per 1 mL di DMSO. Conservare a -20 °C in aliquote da 100 μL.
4. Preparare una soluzione di colorazione X-Gal utilizzando 10 mM di tampone fosfato (pH 7,2), 150 mM di cloruro di sodio, NaCl, 1 mM di cloruro di magnesio, MgCl₂, 3 mM di ferrocianuro di potassio, K₄[FeII(CN)₆], 3 mM di ferricianuro di potassio, K₃[FeIII(CN)₆], e 0,3% t-ottilfenossipolietossietanolo. Conservare a 4 °C al buio.
5. Preparare una soluzione di perossido di idrogeno al 3% diluendo il perossido di idrogeno al 30% 1:10 con acqua deionizzata.
6. Preparare la soluzione di 3,3′-diaminobenzidina (DAB) sciogliendo completamente 1 compressa (10 mg) di DAB in 35 mL di soluzione PBT fresca. Filtrare attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm e conservare a -20 °C in aliquote da 910 μl.
   ATTENZIONE: Smaltire tutti i rifiuti DAB in candeggina per distruggere il DAB.
7. Prepara piatti a base di uova con succo di mela. Aggiungere 35 g di agar agar e 1 L di acqua deionizzata in un pallone da 2 L. Aggiungere 33 g di saccarosio, 2 g di tegosept e 375 ml di succo di mela in un pallone da 1 litro. Scioglietele in autoclave per 30 min. Lasciare raffreddare entrambe le soluzioni a circa 60 °C. Unire e mescolare bene queste soluzioni mescolando. Versare ~11 mL della soluzione combinata per piastra di coltura da 60 mm.
8. Preparare la pasta di lievito frullando il lievito di birra in acqua deionizzata (rapporto 1:0,8) e conservare a 4 °C.

2. Raccolta degli embrioni (giorno 1)

1. Raccogli giovani mosche femmine e maschi (più giovani di 5 giorni) e, per 1-2 giorni, tienile in una gabbia di plastica con una piastra per uova (60 mm x 15 mm) che contiene una piccola quantità di pasta di lievito al centro.
2. Per una raccolta ottimale degli embrioni in fase avanzata di 16 anni, allestire una gabbia per bottiglie con mosche (> 50) intorno alle 17:00 e lasciarle deporre le uova a 25 °C per 3 ore.
3. Trasferire le mosche in una bottiglia per alimenti freschi.
4. Chiudere la piastra per uova con il coperchio e incubare capovolta a 25 °C in un'incubatrice umidificata (~70% di umidità) per una notte.

3. Preparazione degli embrioni per l'immunocolorazione (giorno 2)

1. Aggiungere 1,8 ml di soluzione di PBT alla piastra dell'uovo intorno alle 10:20 e utilizzare un batuffolo di cotone per allentare gli embrioni dalla piastra mentre la si inclina.
   NOTA: Schiacciando delicatamente la pasta di lievito con un batuffolo di cotone, scioglierla nel caso in cui si trovi un gran numero di embrioni su di essa. Inizia a raccogliere gli embrioni ~ 40 minuti prima della fissazione (intorno alle 11:00).
2. Trasferire gli embrioni dalla piastra dell'uovo a una microprovetta da 1,5 ml utilizzando un puntale per pipetta da 1 ml.
3. Lasciare che gli embrioni si stabilizzino e aspirare il più possibile la soluzione di PBT. Sciacquare gli embrioni due volte con 1 mL di soluzione di PBT. Aspirare il più possibile la soluzione di PBT.
4. Riempire la provetta con 1 mL di candeggina al 50% ( cioè diluita in acqua deionizzata) e decorionare gli embrioni incubandoli su un nutatore per 3 minuti a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: Questo passaggio non uccide gli embrioni dechorionati.
5. Lasciare che gli embrioni dechorionati si depositino, aspirare il più possibile la candeggina al 50% e sciacquare gli embrioni 3 volte con 1 ml di soluzione di PBT.
6. Aggiungere 0,5 mL di eptano e successivamente aggiungere 0,5 mL di soluzione di paraformaldeide al 4% alla provetta a RT intorno alle 11:00.
7. Incubare gli embrioni su un nutator per 15 minuti a RT.
8. Rimuovere la soluzione di paraformaldeide al 4% (lo strato inferiore).
9. Aggiungere 0,5 ml di metanolo al 100% e devitellinizzare gli embrioni agitando energicamente la provetta per 30 s.
10. Rimuovere l'eptano (cioè lo strato superiore).
11. Aggiungere 0,5 mL di metanolo al 100% e agitare energicamente la provetta per 10 s.
12. Lasciare che gli embrioni si stabilizzino picchiettando la provetta e aspirare il metanolo il più possibile. Sciacquare gli embrioni con 1 mL di metanolo al 100%, agitando per meno di 10 s.
    NOTA: L'esposizione prolungata al metanolo distrugge l'attività β-Gal.
13. Rimuovere il metanolo e sciacquare gli embrioni devitellinizzati 3 volte con 1 mL di soluzione di PBT.

4. Genotipizzazione degli embrioni mediante colorazione LacZ (giorno 2)

1. Aggiungere 1 mL di soluzione di PBT alla provetta e incubare la provetta in un blocco termico a 37 °C o in un bagno d'acqua per 15 minuti.
2. Durante l'incubazione, porre la soluzione colorante X-Gal (1 mL per provetta) a 65 °C a bagnomaria fino a quando non diventa torbida. Incubarlo a bagnomaria a 37 °C.
3. Aspirare la soluzione di PBT e aggiungere 1 mL di soluzione colorante X-Gal e 20 μL di substrato X-Gal alla provetta.
4. Incubare la provetta a 37 °C con nutazione fino a quando non è evidente un precipitato blu.
   NOTA: Il tempo di incubazione per il 2° e il 3° bilanciatore blu in generale varia da 2 a 4 ore.
5. Rimuovere la soluzione colorante X-Gal e sciacquare gli embrioni 3 volte con 1 mL di soluzione RT PBT.
6. Utilizzando una sonda ad ago o una pinza, selezionare manualmente gli embrioni del genotipo desiderato ( cioè embrioni bianchi non colorati) con un microscopio a dissezione ottica (obiettivi 1,6X-2,5X).
   NOTA: Poiché alcuni bilanciatori blu, come CyO, actina-LacZ e TM3, actina-LacZ, trasportano un costrutto transgenico che esprime β-Gal batterico (LacZ) sotto il controllo del promotore actina, gli embrioni colorati di blu in modo ubiquitario contengono una o due copie dei cromosomi bilanciatori blu. Pertanto, gli embrioni bianchi non colorati sono omozigoti per l'allele letale desiderato.

5. Immunocolorazione di embrioni con anticorpi anti-fasciclina II (giorno 2-3)

1. Raccogliere e trasferire gli embrioni del genotipo desiderato (cioè embrioni bianchi non colorati) in una microprovetta da 0,5 mL utilizzando un puntale per pipetta da 1 mL.
   NOTA: In questa fase, gli embrioni possono essere stadiati approssimativamente secondo criteri morfologici, compresi i modelli di segmentazione della cuticola e le strutture della testa e della coda. Durante l'involuzione della testa, tra le 10 e le 16 ore dopo la deposizione delle uova, l'embrione subisce una marcata riduzione del segmento anteriore.
2. Lavare gli embrioni una volta con 0,4 mL di soluzione di PBT e aggiungere 0,3 mL di soluzione bloccante (5% di siero di capra normale e 5% di DMSO in soluzione di PBT).
3. Bloccare gli embrioni con la nutazione a RT per 15 minuti.
4. Aggiungere 75 μL di anticorpo anti-Fasciclina II e incubare la provetta con nutazione a RT per una notte.
5. Lavare gli embrioni 4 volte con 0,4 ml di soluzione di PBT per almeno 20 minuti per lavaggio.
6. Aggiungere 0,3 mL di soluzione bloccante (5% di siero di capra normale in soluzione di PBT) contenente l'anticorpo anti-perossidasi di capra (topo-topo-HRP) (2 μg/mL) e incubare la provetta con nutazione a RT per una notte.
7. Lavare gli embrioni 6 volte con 0,4 ml di soluzione di PBT per almeno 20 minuti per lavaggio.
8. Aggiungere 0,3 mL di soluzione DAB alla provetta.
   ATTENZIONE: Indossare i guanti e mettere tutti i rifiuti/tubi/puntali DAB nella candeggina.
9. Aggiungere 2 μl di perossido di idrogeno al 3% e incubare la provetta al buio con nutazione a RT fino a produrre la quantità desiderata di precipitato.
   NOTA: Il tempo di incubazione per l'immunoistochimica 1D4 in generale varia da 0,5 a 1 h.
10. Lavare gli embrioni 4 volte con 0,4 mL di soluzione di PBT.
    ATTENZIONE: Rimuovere la soluzione DAB e i primi due lavaggi con una pipetta e gettarli nella candeggina.
11. Aggiungere 0,2 mL di soluzione di glicerolo/PBS al 70% nella provetta e conservare a RT o 4 °C.
    NOTA: Tenere la provetta lontana dalla luce. Preparazioni più chiare possono essere ottenute mettendo gli embrioni in una soluzione di glicerolo/PBS al 90%. Tuttavia, è più difficile sezionare gli embrioni chiariti in una soluzione di glicerolo/PBS al 90% rispetto a quelli chiariti in una soluzione di glicerolo/PBS al 70%.

6. Stadiazione, dissezione, montaggio e imaging degli embrioni (giorno 4)

1. Per la stadiazione, trasferire gli embrioni equilibrati con glicerolo/PBS al 70% su un vetrino.
2. Raccogli embrioni in fase avanzata 16 che hanno i nervi intersegmentali (ISN) del segmento addominale 7 (A7), A8 e A9 convergenti per toccarsi e/o hanno l'intestino medio suddiviso in tre bande.
   NOTA: Gli embrioni colorati con l'anticorpo 1D4 possono essere stadiati in base ai modelli di proiezione degli assoni motori ISN e ISNb. Dopo essere usciti dal sistema nervoso centrale (SNC), i nervi ISN A7, A8 e A9 degli embrioni allo stadio avanzato 16 convergono per toccarsi e successivamente divergono per estendersi fino ai muscoli dorsali (punta di freccia in Figura 1A). Negli embrioni allo stadio intermedio 16, tuttavia, i nervi ISN A7 si estendono in parallelo con i nervi A8/A9 (parentesi quadra in Figura 1B). Inoltre, gli assi di proiezione dei nervi ISNb A6 (perpendicolari ai muscoli ventrolaterali) in entrambi gli emisegmenti sono approssimativamente allineati con l'estremità posteriore dei fascicoli assonici longitudinali del SNC (frecce e una linea in Figura 1C). Questi criteri morfologici variano tra i diversi genotipi. In alternativa, gli embrioni possono essere messi in scena in base alla morfologia intestinale. Prima dello stadio 17, l'intestino medio ha una forma simile a un cuore, mentre l'intestino medio è suddiviso in tre bande dallo stadio 17.
3. Sezionare gli embrioni.
   1. Utilizzando una siringa da 1 ml, estrarre ogni embrione dalla goccia di glicerolo e posizionare l'embrione a faccia in su a faccia in giù. Tagliare la parte anteriore a 1/4 della lunghezza del corpo e la regione più posteriore priva di assoni motori.
   2. Usando una sonda ad ago, sposta l'embrione tagliato fuori dalla goccia di glicerolo, arrotolalo per orientarlo con il lato dorsale rivolto verso l'alto e posizionalo orizzontalmente nel campo.
      NOTA: Quando l'embrione viene spostato fuori dalla goccia di glicerolo, un po' di glicerolo associato all'embrione lo rende appiccicoso.
   3. Taglia l'embrione lungo la linea mediana dorsale usando un singolo ago di tungsteno molto sottile. Fai un piccolo taglio all'estremità posteriore dell'embrione e poi continua a tagliare la linea mediana dorsale verso la parte anteriore; Anche il taglio nella direzione opposta va bene.
   4. Usando una sonda ad ago, sposta l'embrione tagliato sulla linea mediana nella goccia di glicerolo, posizionalo con il lato dorsale rivolto verso l'alto e stacca l'intestino dalla parete corporea dispiegando ciascuna parete corporea in direzione ventrolaterale (diagonale) (obiettivo 2,5X).
      NOTA: Assicurati che la linea mediana dorsale sia completamente tagliata, con conseguente separazione completa tra le pareti del corpo sinistra e destra.
   5. Spostare con cautela l'embrione tagliato sulla linea mediana dalla goccia di glicerolo e quindi adagiare due lembi della parete corporea sul vetrino utilizzando una sonda ad ago sottile (obiettivo 2,5X).
   6. Utilizzando un ago di tungsteno molto sottile, rimuovere gli organi interni dall'embrione sezionato spingendoli lateralmente (obiettivo 5X).
      NOTA: Una descrizione più dettagliata di un'altra procedura di dissezione simile può essere trovata sul sito web.
4. Per il montaggio, aggiungere 2-3 μL di soluzione di glicerolo/PBS al 70% agli embrioni puliti e sezionati e, utilizzando una sonda ad ago sottile, trasferirli su un nuovo vetrino su cui sono stati sparsi al centro 8 μL di soluzione di glicerolo/PBS al 70% (obiettivo 2,5X).
5. Applicare un vetrino coprioggetti (18 mm x 18 mm). Sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con un normale smalto per unghie (va bene sia trasparente che colorato).
6. Acquisizione di immagini ad alta risoluzione (obiettivi a immersione in olio 20X, 40X e 63X) con un microscopio ottico a contrasto di interferenza differenziale (DIC), secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: Una migliore visualizzazione e caratterizzazione fenotipica, specialmente per gli assoni motori ISNb, può essere prodotta utilizzando un obiettivo a immersione in olio 63X.

Figura 1: Stadiazione degli embrioni basata sui modelli di proiezione degli assoni motori ISN e ISNb. (A) Negli embrioni wildtype allo stadio avanzato 16, i nervi ISN A7, A8 e A9 (frecce) convergono per toccarsi (punta di freccia). La parte anteriore è sinistra e la ventrale è abbassata. La barra della scala = 15 μm. (B) Negli embrioni wildtype allo stadio intermedio 16, il nervo ISN A7 si estende in parallelo con i nervi A8/A9 (parentesi quadra). Le frecce indicano i nervi ISN A7, A8 e A9. La parte anteriore è sinistra e la ventrale è abbassata. La barra della scala = 15 μm. (C) Preparazione filettata di embrioni wildtype in stadio avanzato-16 colorati con anticorpo FasII. Gli assi di proiezione (frecce) dei nervi A6 ISNb sinistro e destro sono approssimativamente allineati con l'estremità posteriore dei fascicoli assonici longitudinali del SNC (linea nera). I segmenti addominali A1-A7 sono etichettati nella parte superiore. La parte anteriore è sinistra. La barra della scala = 15 μm.