Imaging in vivo del cervello larvale di pesce zebra per la visualizzazione dei neuroni cerebellari

Abstract

Fonte: Schramm, P. et al. Imaging in vivo di tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish sveglie e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video dimostra l'imaging in vivo dei neuroni cerebellari nelle larve transgeniche di zebrafish, che esprimono proteine fluorescenti nei neuroni di Purkinje. Il processo prevede l'anestetizzazione delle larve, l'immobilizzazione in agarosio e la rimozione accurata della pelle pigmentata per migliorare la penetrazione della luce e l'intensità della fluorescenza. Infine, i campioni preparati vengono ripresi con un microscopio confocale per visualizzare chiaramente i neuroni marcati.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Anestesia delle larve e preparazioni per l'inclusione
   1. Quando si inizia l'esperimento della giornata, trasferire gli animali necessari con una pipetta di plastica Pasteur in una capsula di Petri di 90 mm di diametro, che viene riempita con Danieau (per le larve che sono ancora conservate in una capsula di Petri con Danieau) o con acqua della struttura ittica (per le larve che hanno più di 7 giorni dopo la fecondazione [dpf] e sono conservate nell'impianto ittico).
      1. Quando si pipettano i pesci di età superiore alle 2 settimane, assicurarsi che l'apertura della pipetta sia sufficientemente grande da evitare di ferire i pesci durante il trasferimento. Non usare una rete perché danneggerebbe fisicamente i pesci, soprattutto le larve più giovani.
   2. Aggiungi rotifera o artemia naupli adatti alle dimensioni delle larve conservate nella capsula di Petri per garantire il libero accesso al cibo e il massimo stato di salute delle larve e ridurre lo stress.
   3. Per l'inclusione, trasferire le larve selezionate in una piastra di Petri di 35 mm di diametro riempita con liquido cerebrospinale artificiale (ACSF). Aggiungere il volume necessario di d-Tubocurarina per raggiungere una concentrazione di lavoro/dose efficace di 10 μM e attendere qualche minuto fino a quando le larve non sono completamente immobilizzate.
      NOTA: Quando i pesci invecchiano o se è necessaria un'anestesia completa più rapida (meno di 5 minuti), è possibile aumentare la concentrazione di d-Tubocurarina (la LD50 per i topi è di 0,13 mg/kg per via endovenosa). È anche possibile utilizzare un anestetico diverso, come la α-bungarotossina (concentrazione di lavoro: 1 mg/mL), che ha lo stesso effetto del curaro e mantiene anche il cervello completamente attivo. Se un cervello completamente attivo non è necessario per l'argomento di interesse, la tricaina in una dose non letale (0,02%) è anche un'opzione per anestetizzare completamente le larve. Tuttavia, la tricaina blocca i canali del sodio, compromettendo così l'attività cerebrale.
   4. Preparare la camera di montaggio prendendo il coperchio della capsula di Petri da 35 mm di diametro, capovolgere il coperchio e posizionare un vetrino coprioggetti quadrato (24 x 24 mm) sul fondo del coperchio. Vedere Figura 1 (parte superiore) per una descrizione schematica di questi passaggi. La superficie più liscia del vetro impedisce lo scivolamento del blocco di agarosio, che contiene le larve durante la procedura di apertura del cranio.
   5. Aliquotare la quantità di ACSF necessaria per la giornata in un flaconcino appropriato (ad es. provetta da 50 ml, becher, flacone Schott, ecc.) e ossigenarla con carbogeno (5% CO₂, 95% O₂). Se si esegue l'imaging solo della morfologia (ad esempio, modelli di fluorescenza), l'ACSF è ancora necessario per garantire l'integrità del cervello e che le cellule non siano influenzate negativamente dagli effetti dell'osmolarità, ma non è necessaria l'ossigenazione dell'ACSF. Questo passaggio deve essere eseguito solo quando è necessaria una piena attività cerebrale per l'imaging.
      NOTA: Per una saturazione ottimale di ossigeno del fluido, aggiungere una pietra porosa all'estremità del tubo di carbogeno. Per garantire un livello di ossigeno sufficientemente elevato, è necessario sostituire l'ACSF nelle camere di imaging con ACSF appena ossigenato ogni 20-60 minuti, a seconda del numero e dell'età delle larve incorporate nella stessa camera di imaging (ad esempio, per una singola larva incorporata è sufficiente lo scambio di ACSF ogni ora. Per sei larve di età superiore a 14 dpf incorporate in parallelo, è necessario sostituire l'ACSF ogni 20 minuti), quindi pianificare la quantità necessaria di ACSF saturo di ossigeno in base all'esperimento pianificato.
2. Inclusione delle larve
   1. Trasferire le larve completamente anestetizzate con una pipetta di plastica Pasteur nella camera di montaggio preparata (al punto 1.4). Quindi, rimuovere con cura il terreno in eccesso per evitare la diluizione dell'agarosio a basso punto di fusione (LM). Tutti i passaggi seguenti devono essere eseguiti sotto uno stereomicroscopio con un ingrandimento sufficiente.
      NOTA: Inclinare la camera di montaggio può aiutare a rimuovere completamente il supporto.
   2. Procedere immediatamente alla fase successiva, aggiungendo una goccia di LM-agarosio sufficientemente grande sopra le larve (circa 1 ml, a seconda delle dimensioni delle larve) per proteggere gli animali dall'essiccamento e ridurre lo stress inutile.
   3. Orientare le larve in posizione prima che l'agarosio si solidifichi. Assicurarsi che la parte dorsale delle larve sia diretta verso l'alto. Inoltre, assicurati di incorporare le larve il più vicino possibile alla superficie dell'agarosio.
      NOTA: A seconda delle dimensioni e del numero di larve che si prevede di incorporare contemporaneamente, è possibile regolare la concentrazione di agarosio. Ad esempio, per 1-3 larve di 30 dpf, si raccomanda una concentrazione dell'1,8%-2% di LM-agarosio. Per 1-4 larve di 7 dpf, è più praticabile utilizzare il 2,5% di LM-agarosio, mentre per 5-8 larve, il 2% è più adatto. Se è necessario un cervello completamente attivo, si consiglia di incorporare solo tre pesci contemporaneamente per ridurre il tempo necessario per operare le larve. In generale, si raccomanda di utilizzare concentrazioni più basse (1,8%-2%) man mano che le larve invecchiano o più larve si prevede di incorporare contemporaneamente.
   4. Se le immagini vengono registrate con un microscopio invertito, tagliare il blocco di agarosio contenente le larve in una piccola forma cuboide. Questo è importante per il successivo trasferimento delle larve nella camera di imaging. Se si utilizza un microscopio verticale, tale ritaglio non è necessario, perché la camera di montaggio può essere utilizzata anche come camera di imaging. Nella Figura 1 (parte superiore), si può trovare una descrizione schematica di questi passaggi.
3. Esporre il cervello
   NOTA: Tutti i seguenti passaggi devono essere eseguiti con la massima cura per non ferire inutilmente le larve. Se per l'esperimento è necessario un cervello completamente attivo, tenete presente che ogni secondo che passa, mentre il pesce è ancora completamente montato in agarosio e ha il cranio aperto senza ACSF ossigenato, il cervello soffrirà di mancanza di ossigeno e si seccherà. Gli effetti della carenza di ossigeno diventeranno ancora più drammatici quanto più vecchie sono le larve incorporate. Pertanto, è importante eseguire l'intervento chirurgico non solo nel più breve tempo possibile, ma anche con la massima precisione per evitare danni meccanici al cervello con l'ago. I passaggi 3.2-3.4 non dovrebbero richiedere più di 30 secondi per pesce quando addestrati.
4. Iniziare l'intervento non appena l'agarosio si è solidificato. Innanzitutto, taglia via tutto l'agarosio in eccesso sopra la regione del cervello di interesse per ottenere libero accesso alla testa e uno spazio di lavoro chiaro. Se la parte dorsale della testa sporge già dall'agarosio, salta questo passaggio.
5. A seconda della regione di interesse, scegli un punto per iniziare con l'intervento. Prendi l'ago di vetro e fai una piccola incisione attraverso la pelle senza penetrare troppo in profondità nel tessuto. Questo sarà il punto di partenza per staccare la pelle sovrapposta.
   NOTA: Per ottenere risultati ottimali, non iniziare mai direttamente sopra la regione di interesse per ridurre il rischio di danneggiare strutture importanti. Se necessario, è possibile iniziare posteriormente al rombencefalo e lavorare in avanti fino a quando l'area indesiderata della pelle non viene staccata.
6. Continuare con tagli molto piccoli lungo la parte della pelle, cercando di rimuovere muovendo appena l'ago appena sotto la superficie. La maggior parte delle volte non è necessario muoversi completamente intorno al cervello e ritagliare un pezzo di pelle e cranio simile a un cerchio, ma piuttosto fare due incisioni lungo la testa e poi spingere via la pelle da un lato o dall'altro. La Figura 2 mostra una rappresentazione schematica della strategia di taglio ottimale per ottenere il libero accesso al cervelletto.
   NOTA: Questa microchirurgia è una procedura delicata e molto probabilmente avrà bisogno di un po' di allenamento per rimuovere perfettamente la pelle senza danneggiare il cervello sottostante. Si raccomanda inoltre di trovare la strategia di taglio ottimale per la regione cerebrale di interesse e di attenersi ad essa per tutta la durata dell'esperimento.
7. Immediatamente dopo aver rimosso la pelle da tutte le larve incorporate, versare ACSF (ossigenato) sull'agarosio per inondare le particelle di pelle e sangue indesiderate, mantenere il cervello completamente attivo e proteggerlo dalla disidratazione.
   NOTA: Se per l'esperimento è necessario un cervello sano, si raccomanda di mangiare un massimo di tre pesci alla volta.
8. Se si utilizza un microscopio verticale, iniziare direttamente con l'imaging.
   1. Quando si utilizza un microscopio invertito, far scorrere una piccola spatola sotto il blocco di agarosio cuboide (passaggio 2.4).
   2. Aggiungere una piccola goccia di LM-agarosio sul fondo della camera di imaging (ad esempio, un piatto con fondo di vetro) e capovolgere immediatamente il blocco di agarosio contenente le larve con la spatola per 180° e spingerlo delicatamente sul fondo della camera di imaging, mentre la goccia di agarosio liquido funge da colla.
   3. Quando l'agarosio si è solidificato, riempire la camera di imaging con ACSF (ossigenato), quindi iniziare l'imaging. Vedere Figura 1 (parte inferiore) per una descrizione schematica.
9. Quando è richiesta la piena attività cerebrale per l'esperimento, assicurarsi sempre che l'ACSF nella camera di imaging abbia un livello di ossigeno sufficientemente alto. Per garantire ciò, il terreno deve essere sostituito con ACSF appena ossigenato ogni 20-60 minuti (a seconda del numero e delle dimensioni dei pesci, delle dimensioni e della superficie della camera di imaging e della durata dell'imaging).

Risultati

Figura 1: Procedura schematica per la preparazione di zebrafish a cranio aperto per l'imaging in vivo in modo graduale. Le istruzioni di lavoro per i diversi passaggi si trovano nel grafico stesso. Gr...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo Nome Azienda Numero di catalogo Commenti Microscopio a scansione laser confocaleLeicaTCS SP8 d-TubocurareSigma-AldrichT2379-100MG Capillare in vetro tipo 1WPI1B150F-4 Capillare in vetro tipo 2Apparecchio HarvardGC100F-10 Vetrino coprioggettideltalabD102424 Camera di imagingIbidi81156 LM-AgaroseCondalab8050.55 Fotocamera per microscopioLeicaDFC9000 GTC Needle-Puller tipo 1NARISHIGEModello PC-10 Needle-Puller tipo 2Sutter InstrumentsModello P-2000 Pasteur-Pipettes 3mlA.Hartenstein20170718 TricainSigma-AldrichE10521-50G Piastra di Petri da 35 mmSarstedt833900 Piastra di Petri da 90 mmSarstedt821473001