Caratterizzazione delle proprietà meccaniche del tessuto cerebrale di topo mediante microscopia a forza atomica

Abstract

Fonte: Canovic, E. P., et al. Caratterizzazione delle proprietà meccaniche multiscala del tessuto cerebrale mediante microscopia a forza atomica, indentazione dell'impatto e reometria. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video dimostra l'uso della microscopia a forza atomica (AFM) per misurare le proprietà viscoelastiche del tessuto cerebrale, dove un cantilever con una sonda sferica interagisce con il tessuto e si piega sotto le forze applicate. Un raggio laser deviato su un rivelatore traccia il cantilever per misurare la profondità di indentazione e il rilassamento della forza, consentendo la caratterizzazione delle proprietà meccaniche del tessuto.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Indentazione abilitata al microscopio a forza atomica (AFM)

1. Preparare piastre Petri (P60) da 60 mm di diametro con un bioadesivo derivato dalle cozze secondo le istruzioni del produttore.
   1. Preparare una scorta di soluzione tampone neutra costituita da bicarbonato di sodio 0,1 M in acqua sterile con un pH ottimale di 8,0. Filtrare-sterilizzare (0,2 micron) il tampone bicarbonato di sodio e conservarlo a 4 °C.
   2. In una cappa a flusso laminare, miscelare una soluzione di bioadesivo derivato da cozze al 6,25% e idrossido di sodio (NaOH) al 3,125% nel tampone bicarbonato di sodio.
   3. Pipettare 100 μl di soluzione bioadesiva su una piastra di Petri (P60) di 60 mm di diametro e utilizzare un puntale per pipetta per distribuire la soluzione in un cerchio di 3-5 cm di diametro.
   4. Lasciare le piastre P60 scoperte in una cappa a flusso laminare e lasciare asciugare la soluzione (~30 min). Lavare le stoviglie 1 volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e 2 volte con acqua sterile. Lasciare asciugare le stoviglie all'aria in una cappa a flusso laminare e conservarle in un sacchetto di plastica sigillato a 4 °C per un massimo di 1 mese.
2. Calibrare l'AFM e impostare un campione di cervello nell'AFM. nota: Seguire le istruzioni di calibrazione AFM secondo il produttore.
   1. Carica con attenzione una sonda AFM con una costante nominale della molla di 0,03 N/m e una perlina di borosilicato di 20 μm di diametro nel supporto della sonda.
   2. Calibrare la costante della molla e la sensibilità della leva ottica inversa (InvOLS) del cantilever AFM utilizzando il metodo della regolazione termica.
      NOTA: Una volta calcolata la costante della molla per una sonda AFM, dovrebbe rimanere costante con l'uso ripetuto. Tuttavia, l'InvOLS a sbalzo dovrà essere ricalibrato ogni volta che il laser viene riallineato con il cantilever. Inoltre, la calibrazione deve essere eseguita su un substrato di diversi ordini di grandezza più rigido del cantilever, come il polistirene.
   3. Accendere il riscaldatore montato sul palco e impostare la temperatura a 37 °C.
   4. Monta la fetta di cervello sui piatti P60.
      1. Versa delicatamente una fetta di cervello spessa 350 μm e il mezzo indipendente dall'anidride carbonica (CO₂) dal pallone a fondo tondo in un piatto P60 rivestito con il bioadesivo derivato dalle cozze.
      2. Posiziona la fetta di cervello al centro del piatto P60 inclinandola delicatamente. Se necessario, pipettare lentamente il terreno da una pipetta manuale per aprire una fetta di cervello che si è ripiegata su se stessa o, meglio ancora, posizionare la fetta di cervello al centro del piatto.
      3. Rimuovere con cautela il terreno in eccesso utilizzando una pipetta P1000 (non utilizzare l'aspirapolvere).
      4. Mettere un coperchio sul piatto P60 e lasciare che la fetta di cervello aderisca per 20 minuti.
   5. Rimuovere la testa AFM, posizionare la fetta di cervello montata nel piatto P60 sullo stadio AFM e aggiungere ~2 ml di terreno indipendente da CO₂ preriscaldato.
   6. Aggiungere con cautela una goccia di terreno sulla sonda AFM per proteggerla dalla rottura dovuta alla tensione superficiale quando viene abbassata nel mezzo che circonda la fetta di cervello.
   7. Riposizionare la testa AFM sul tavolino e iniziare ad abbassare la testa fino a quando non è immersa nel supporto.
   8. Utilizzando la telecamera CCD (charge-coupled device) top-view, riposizionare il laser sul cantilever.
      NOTA: L'allineamento del laser sul cantilever sarà leggermente cambiato a causa della differenza nell'indice di rifrazione dell'aria e del fluido.
   9. Attendere 5 minuti affinché il cantilever si adatti ad essere immerso in un liquido caldo, quindi reimpostare l'allineamento dello specchio su una deflessione libera di 0 V.
   10. Eseguire uno spettro termico sulla sonda AFM secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare l'adattamento del primo picco termico per ricalcolare l'InvOLS della sonda AFM nel fluido.
   11. Utilizzando il microscopio ottico, spostare lo stadio del campione in modo che la regione cerebrale di interesse sia al di sotto della sonda AFM. nota: Il corpo calloso apparirà scuro in quanto è più opaco della materia grigia circostante. La corteccia è superiore al corpo calloso.
   12. Reimpostare l'allineamento dello specchio su una deflessione libera di 0 V.
   13. Sul misuratore di somma e deflessione nel software AFM, fare clic su "Engage" per innestare la testa AFM.
   14. Utilizzando la manopola di posizione sulla testa AFM, abbassare la testa fino a quando non viene stabilito il contatto tra il cantilever e il campione.
3. Condurre esperimenti di conformità al creep.
   1. Costruisci una funzione di forza applicata nell'editor di funzioni del software. La funzione di forza consiste in una rampa di 0,1 secondi fino a un punto di impostazione di 5 nN e mantenendolo per 20 secondi, seguita da una rampa di 1 secondo fino a una forza applicata di 0 nN.
      1. Sul pannello principale di indentazione, sotto il metodo di indentazione, seleziona "Carica" per la modalità Indentatore, "N" per le unità e "Editor di funzioni" per la funzione Indentatore.
      2. Nell'editor delle funzioni, nel pannello Parms segmento, creare un segmento della funzione di forza applicata che inizia a 0 nN e termina a 5 nN, con un tempo di 0,1 sec. Fare clic su "Inserisci -->".
      3. Per il segmento successivo, impostare l'inizio su 5 nN, la fine su 5 nN e il tempo su 20 sec. Fare clic su "Inserisci -->".
      4. Per il segmento finale, impostare l'inizio su 5 nN, la fine su 0 nN e il tempo su 1 secondo. Quindi, fai clic su "Disegna" e chiudi la finestra dell'editor delle funzioni.
   2. Nella scheda Forza del pannello principale, selezionare "rampa penetratore dopo l'innesco" e impostare la funzione di forza applicata in modo che si attivi dopo aver raggiunto un punto di innesco di 0,1 V.
   3. Fai clic su "Forza singola" nella parte inferiore della scheda Forza del pannello principale, che attiverà la funzione di forza costruita-applicata per la conformità allo scorrimento.
   4. Dopo che l'indentazione a forza singola è terminata, sollevare la testa AFM in modo che sia fuori contatto con il campione. Quindi, reinnestare la testa e azzerare la deflessione libera.
   5. Riposizionare lo stadio campione per individuare una nuova area di interesse e abbassare la testa AFM per stabilire il contatto. nota: La testa AFM deve essere retratta dalla superficie del campione quando lo stadio del campione viene spostato. In caso contrario, si può danneggiare il delicato cantilever AFM.
   6. Ripetere i passaggi fino a quando non è stata raccolta la quantità di dati desiderata.
4. Condurre esperimenti di rilassamento della forza.
   1. Costruisci una funzione di indentazione applicata nell'editor di funzioni del software. La funzione di indentazione consiste in una rampa di 0,1 secondi fino a un punto di impostazione di 3 μm e mantenendolo premuto per 20 secondi, seguito da una rampa di 1 secondo fino a una profondità di indentazione di 0 μm.
      1. Sul pannello principale di indentazione, sotto il metodo di indentazione, seleziona "Rientro" per Modalità indentatore, "m" per unità e "Editor funzioni" per Funzione penetratore.
      2. Nell'editor delle funzioni, nel pannello Parms dei segmenti, creare un segmento della funzione di forza applicata che inizia a 0 μm e termina a 3 μm, con un tempo di 0,1 secondi. Fare clic su "Inserisci -->".
      3. Per il segmento successivo, impostare l'inizio su 3 μm, la fine su 3 μm e il tempo su 20 secondi. Fare clic su "Inserisci -->".
      4. Per il segmento finale, impostare l'inizio su 3 μm, la fine su 0 μm e il tempo su 1 secondo. Quindi fare clic su "Disegna" e chiudere la finestra dell'Editor funzioni.
   2. Nella scheda Forza del pannello principale, selezionare "rampa penetratore dopo l'innesco" e impostare la funzione di forza applicata in modo che si attivi dopo aver raggiunto un punto di innesco di 0,1 V.
   3. Fai clic su "Forza singola" nella parte inferiore della scheda Forza del pannello principale per attivare la funzione di rientro costruita-applicata per il rilassamento della forza.
   4. Al termine dell'indentazione a forza singola, sollevare la testa AFM in modo che non sia a contatto con il campione, quindi reinnestare la testa e azzerare nuovamente la deflessione.
   5. Riposizionare il tavolino per individuare una nuova area di interesse e abbassare la testa per stabilire il contatto.
   6. Ripetere entrambe le misurazioni fino a quando non è stata raccolta la quantità di dati desiderata.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Hibernate-A medium	Gibco	A1247501	CO2-indipendente da un mezzo neurale per tessuti adulti
Microscopio a forza atomica, MFP-3D-BIO	Asylum Research	-
Petri dish heater	Ricerca sull'asilo	-
Sonda AFM, 0,03 N/m, sonda borosilicata con raggio 10 um	Novascan	PT.
Cell-Tak	Corning	354240	Bioadesivo derivato dalle cozze
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	S5761	È possibile utilizzare fornitori alternativi
Idrossido di sodio, 1N	Sigma-Aldrich	59223C	È possibile utilizzare fornitori alternativi

GS