Misurazione delle proprietà viscoelastiche del tessuto cerebrale del topo mediante reometria

Abstract

Fonte: Canovic, E. P., et al. Caratterizzazione delle proprietà meccaniche multiscala del tessuto cerebrale mediante microscopia a forza atomica, indentazione dell'impatto e reometria. J. Vis. Exp. (2016)

In questo video, un reometro è stato utilizzato per applicare un movimento rotatorio oscillatorio controllato al tessuto cerebrale per generare una deformazione di taglio e valutare le proprietà viscose ed elastiche del tessuto. Il reometro, in quanto strumento funzionale, fornisce approfondimenti sulla meccanica cerebrale durante lesioni o malattie neurodegenerative.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Reologia
   1. Imposta e calibra il reometro secondo le istruzioni del produttore.
      1. Inizializzare il reometro aprendo il dispositivo/pannello di controllo. Nella scheda del pannello di controllo, fai clic su "inizializza".
      2. Montare la piastra di misura da 25 mm di diametro (PP25) e il sistema termico.
      3. (Facoltativo) Per ridurre lo scivolamento tra le piastre del reometro e il tessuto, ritagliare delle fette di carta vetrata adesiva che corrispondano alla forma della piastra del reometro superiore e far aderire la carta vetrata alla piastra superiore e inferiore.
      4. Stabilire il contatto tra le piastre superiore e inferiore facendo clic su "imposta spazio zero" sul pannello di controllo.
      5. Azzerare il trasduttore di forza normale facendo clic su "ripristina forza normale".
      6. Eseguire un test di inerzia aprendo la scheda di servizio sul pannello di controllo, facendo clic su "sistema di misurazione" e quindi su "test di inerzia". Registra la vecchia e la nuova inerzia. Verificare che l'inerzia rientri nel limite consentito per la sonda, come indicato dal produttore.
2. Caricare il campione nel reometro.
   1. Dopo aver raccolto il tessuto e affettato un segmento coronale del cervello di maiale a ~5 mm di spessore, conservarlo su ghiaccio in un mezzo indipendente dalla CO2.
   2. Posiziona il cervello tra le due piastre. Rimuovere le goccioline d'acqua di grandi dimensioni dalla superficie superiore e inferiore del campione per evitare lo scivolamento, ma non asciugare il campione.
   3. Abbassare lentamente la piastra di misurazione fino a quando la piastra non è completamente a contatto con la superficie superiore del tessuto e la forza normale misurata è costante a 0,01 mN dopo un periodo di rilassamento di 5-10 minuti.
      1. Nel pannello di controllo, inserire successivamente le altezze più basse nella casella della posizione di misurazione e fare clic su "posizione di misurazione" per abbassare lentamente la piastra di misurazione.
      2. Quando si trova a una distanza di un millimetro dal contatto con il tessuto, abbassare la piastra di misurazione con incrementi di 0,1 mm fino a quando la piastra non è completamente a contatto con la superficie superiore del tessuto. Assicurarsi che la forza normale misurata sia costantemente a 0,01 mN dopo un periodo di rilassamento di 5-10 minuti.
      3. Registrare la forza normale misurata inizialmente. Misurazioni ripetute devono essere effettuate alle stesse sollecitazioni/deformazioni di compressione.
   4. Se il campione supera il diametro della piastra, tagliarlo con una lama di plastica. Pipettare un piccolo volume (~1-2 ml) di terreno sui bordi del campione per idratare il tessuto.
   5. (Facoltativo) Abbassare la cappa termica. Sul pannello di controllo, impostare la temperatura a 37 °C e fare clic su "imposta".
3. Eseguire uno sweep di ampiezza per stabilire l'intervallo viscoelastico lineare del materiale (, cioè , le deformazioni di taglio alle quali G' e G'' a frequenze di interesse (, ad esempio, 1 rad/sec).
   1. Seleziona "file/nuovo". Nella scheda del gel, seleziona "Amplitude sweep: LVE-range". Seleziona la finestra e fai clic su "Misura 1: Ampiezza sweep". Fare doppio clic sulla casella di oscillazione. Inserisci la deformazione iniziale e finale ( ad esempio, da 0,01 a 105), la frequenza ( ad esempio, 1 rad/sec) e il numero di punti per decennio ( ad esempio, 6 punti/dec). Seleziona "ok" e fai clic su "Avvia".
   2. Ripetere questa procedura per diverse fette con prove ripetute per garantire la coerenza della gamma elastica lineare. La compressione assiale del campione deve rimanere costante tra i campioni.
4. Condurre uno sweep di frequenza del tessuto a una deformazione nell'intervallo viscoelastico lineare del tessuto ( ad esempio, 1% di deformazione) e in un intervallo di frequenza di interesse ( ad esempio , 0,1-100 rad/sec).
   1. Fai clic su "file/nuovo" e nella scheda del gel seleziona "Scansione frequenza". Fare clic su Finestra/Misura 1: Sweep di frequenza. Fare doppio clic sulla casella di oscillazione. Inserisci l'intervallo di frequenza ( ad esempio , da 0,1 a 100 rad/sec), la deformazione ( ad esempio , deformazione 1%) e il numero di punti per decennio ( ad esempio , 6 punti/dec). Selezionare "ok" e fare clic su "Avvia" per avviare lo sweep di frequenza.
5. Ripeti lo sweep della frequenza (passaggio 1.4) in duplicati o triplicati.

Esamina i dati che vengono calcolati ed esportati automaticamente dal reometro: G' e G" in funzione della frequenza (spazzamento di frequenza) o della deformazione di taglio (spazzamento di ampiezza). NOTA: G' e G'' sono calcolati dall'ampiezza della coppia di reazione (massima) del campione T'0, e dall'angolo di spostamento rotazionale (o angolo di deflessione) φ°, e dal ritardo di fase φ, della risposta del campione alla deformazione oscillatoria applicata (Figura 1):

dove R, e h sono il raggio e l'altezza del campione.

Results

Figura 1. Illustrazione di esperimenti di reometro a piastre parallele. (A) Schema dell'esperimento del reometro a piastre parallele e definizioni relative alla deformazione di taglio oscillatoria applicata. (B) Deformazione applicata rappres...

Materials