Una tecnica per l'aspirazione e il trattamento percutaneo degli spermatozoi dell'epididimo

Abstract

Questo video mostra l'aspirazione percutanea di spermatozoi epididimali da un paziente con azoospermia, una condizione caratterizzata dall'assenza di spermatozoi nel liquido seminale. La procedura prevede la disinfezione dell'area scrotale, l'aspirazione del liquido epididimico utilizzando una siringa con una soluzione di coltura specializzata e l'elaborazione del campione raccolto per isolare gli spermatozoi vitali. Gli spermatozoi preparati sono quindi pronti per l'uso nelle procedure avanzate di trattamento dell'infertilità.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Preparazione preoperatoria

1. Preparazione delle forniture chirurgiche
   1. Preparare le forniture necessarie per la procedura chirurgica, tra cui un pacchetto di strumenti chirurgici, due siringhe da 5 ml dotate di un ago da 0,7 mm (0,7 x 32 Thin Wall Long Bevel (TWLB)), 60 ml di soluzione disinfettante, due paia di guanti di gomma sterili e un pezzo di medicazione adesiva sterile.
   2. Chiedere agli infermieri di esaminare la confezione di strumenti chirurgici sottoposti a sterilizzazione a vapore ad alta pressione per verificare la presenza di eventuali danni o scadenze. Una volta confermato che non ci sono problemi, posizionarlo sul tavolo dello strumento e aprire lo strato esterno.
   3. Per gli andrologi: indossare guanti di gomma sterili, quindi aprire lo strato interno della confezione degli strumenti chirurgici per verificare se il nastro indicatore di sterilizzazione è qualificato o meno, oltre ad assicurarsi che tutti gli strumenti all'interno siano completi.
   4. Preparare due siringhe da 5 ml dotate di aghi da 0,7 mm (0,7 x 32 TWLB) per l'anestesia e la chirurgia, quindi aprire la fiala contenente lidocaina per iniezione.
   5. Utilizzare una siringa sterile da 5 ml per aspirare l'iniezione di lidocaina, eliminando successivamente le bolle d'aria dalla siringa.
2. Preparazione del paziente sottoposto a intervento chirurgico
   1. Organizzare la preparazione della pelle per il paziente. Radere il pube del perineo usando un rasoio usa e getta e lavare il perineo e la pelle circostante con acqua saponata per assicurarsi che non ci siano pubi o macchie in eccesso.
   2. Posizionare il paziente sul tavolo operatorio in posizione litotomica, rimuovere i pantaloni e fissare l'indumento superiore sopra l'ombelico per esporre completamente il perineo e l'addome inferiore sotto l'ombelico.
   3. Regolare l'angolazione della lampada senza ombre per illuminare lo scroto del paziente.
   4. Utilizzare una pinza ovale per afferrare una sfera di garza sterile, che viene poi completamente immersa nella soluzione disinfettante per avviare il processo di disinfezione. Eseguire la disinfezione della pelle dalla periferia allo scroto nel seguente ordine: basso addome, parte anteriore e interna delle cosce, zona perineale, pene e scroto.
   5. Dopo la disinfezione iniziale, sostituire la sfera di garza sterile e ripetere il processo di disinfezione. Dopo tre cicli di disinfezione, il processo di disinfezione preoperatoria è completato.
   6. Iniziare il processo di posa degli asciugamani sterili al termine della disinfezione. Innanzitutto, posizionare un asciugamano quadrato sterile sotto i glutei del paziente, quindi stendere un asciugamano forato sterile intorno all'area chirurgica e ai suoi dintorni, esponendo completamente lo scroto nell'area del foro.
3. Preparazione della soluzione di coltura G-MOPS-PLUS
   1. Chiedere ai tecnici della sala di coltura embrionale di trasferire circa 2 ml di soluzione di coltura G-MOPS-PLUS nel piatto di coltura utilizzando una pipetta sterile Pasteur. Chiudere correttamente il coperchio e successivamente consegnarlo all'infermiera in sala operatoria attraverso la finestra di trasferimento.
   2. Posizionare la capsula di coltura sull'asciugamano sterile sul tavolo degli strumenti e aprire il coperchio.
   3. Utilizzando un'altra siringa da 5 mL, aspirare circa 0,2 mL di soluzione di coltura G-MOPS-PLUS e successivamente rimuovere le bolle d'aria per un utilizzo futuro.

2. Anestesia e chirurgia

1. Per gli andrologi: tenere la siringa riempita con iniezione di lidocaina nella mano destra mentre si fissa il funicolo spermatico del paziente con la mano sinistra. Pungere per via sottocutanea e iniettare una piccola quantità di lidocaina per formare un pomfo. Quindi, pungere per via sottocutanea e approfondire il tessuto del funicolo spermatico, iniziando a iniettare circa 0,5 ml di lidocaina dopo aver confermato l'assenza di ritorno di sangue. Per ottenere un effetto migliore dell'anestesia con blocco del cordone spermatico, cambiare la direzione dell'ago per iniezione da 2 a 3 volte nello stesso punto di puntura e ripetere l'operazione di iniezione di lidocaina nel funicolo spermatico.
2. Tenere lo scroto del paziente con la mano sinistra, fissando l'epididimo che richiede la puntura. Alla palpazione, confermare la posizione dell'epididimo in cui è necessaria la puntura chirurgica utilizzando la mano destra. Quindi, tenere la siringa contenente lidocaina sopra menzionata e iniettarla sotto la pelle nel sito di puntura per ottenere l'anestesia di infiltrazione locale.
3. Tenere lo scroto del paziente con la mano sinistra, fissando l'epididimo che richiede la puntura. Quindi, tenere la siringa da 5 mL contenente la soluzione di coltura G-MOPS-PLUS (0,2 mL) nella mano destra e perforare perpendicolarmente alla pelle, penetrando nel tessuto epididimale. Mantenere la pressione negativa nella siringa e perforare ripetutamente il tessuto epididimo in modo che il liquido epididimo entri attraverso l'ago sotto l'effetto della pressione negativa.
4. Continuare a mantenere la pressione negativa ed estrarre lentamente l'ago della puntura. Iniettare il liquido epididimo estratto nella piastra di coltura. Dopo aver completato l'iniezione, aspirare la soluzione di coltura G-MOPS-PLUS nelle vicinanze per risciacquare la siringa al fine di massimizzare la quantità di liquido epididimico raccolto iniettato nella piastra di coltura.

3. Trattamento di campioni chirurgici

1. Ricerca e osservazione di spermatozoi epididimali
   1. Trasferire la piastra di coltura contenente il fluido di coltura G-MOPS-PLUS e il liquido epididimico al tecnico di laboratorio degli embrioni attraverso la finestra di trasferimento.
   2. I tecnici della sala di coltura embrionale prendono in consegna il piatto di coltura e lo posizionano sul tavolino di un microscopio ottico invertito, fissandolo. Accendere l'interruttore di alimentazione del microscopio e ruotare il pulsante di regolazione della luce su un'intensità luminosa appropriata.
   3. Ruotare il convertitore del microscopio ottico invertito, selezionare l'obiettivo 10x, ruotare a turno le spirali di messa a fuoco grossolana e fine per regolare la lunghezza focale. Osservare la situazione di messa a fuoco e cercare gli spermatozoi dell'epididimo al microscopio.
   4. Continuare a ruotare il convertitore del microscopio invertito sulla lente dell'obiettivo 40x, ruotare la spirale di messa a fuoco fine per regolare la lunghezza focale e osservare gli spermatozoi dell'epididimo campo per campo. Valutare il numero e la qualità degli spermatozoi dell'epididimo. Si può vedere che gli spermatozoi dell'epididimo normale sono maturati e hanno acquisito la capacità di muoversi.
2. Trattamento degli spermatozoi dell'epididimo
   1. Dopo aver osservato una quantità sufficiente di spermatozoi epididimali attivi, trasferire il liquido nel piatto di coltura in una provetta da centrifuga da 15 ml attraverso una pipetta sterile Pasteur.
   2. Posizionare la provetta da centrifuga sopra sul vassoio della bilancia e utilizzare una provetta da centrifuga della stessa specifica contenente acqua sterile per livellare.
   3. Aprire lo sportello della centrifuga, posizionare le provette della centrifuga nello slot della scheda in modo simmetrico, quindi chiudere lo sportello della centrifuga. Impostare la forza centrifuga a 500 x g e il tempo di centrifugazione a 5 minuti attraverso il pannello di controllo. Premere il pulsante START sul pannello di controllo per avviare il processo di centrifugazione.
   4. Al termine del processo di centrifugazione, aprire lo sportello della centrifuga e rimuovere la provetta da centrifuga contenente il liquido epididimale. Svitare il coperchio, aspirare delicatamente il surnatante con una pipetta sterile Pasteur ed eliminare il surnatante aspirato.
   5. Utilizzando una pipetta sterile Pasteur, trasferire circa 2 mL di soluzione di coltura G-IVF-PLUS nella provetta da centrifuga. Quindi pipettare delicatamente la soluzione nella provetta da centrifuga per risospendere accuratamente.
   6. Ripetere i processi di bilanciamento, centrifugazione e rimozione dello strato superiore di liquido.
   7. In base alle esigenze dell'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI), trasferire circa 0,5 ml di soluzione di coltura G-IVF-PLUS nella provetta da centrifuga utilizzando una pipetta sterile Pasteur e soffiare delicatamente gli spermatozoi dell'epididimo sul fondo della provetta da centrifuga per renderla completamente sospesa.
   8. Utilizzare gli spermatozoi dell'epididimo completamente sospesi direttamente per il processo ICSI.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo Nome Azienda Numero di catalogo Commenti CentrifugeOrigio MAXIG123511110440Max RPM: 4000; RCF massimo: 2826 x gCentrifuge tubeFalcon35209515 mLCombinazione provetta standShenzhen Zhicheng Long Technology Co., LTDNone Piatto di culturaFalcon35300135 mm x 10 mmSoluzione disinfettanteShanghai Likang Disinfection high-tech Co., LTD20230801S<60 mL;>'Vitrolife Svezia AB511574soluzione di coltura per il trattamento del fluido epididimale<tr style='height:20px;'>G-MOPS PLUSVitrolife Sweden AB511712soluzione culturale per l'operazione di foraturaHigh Security Embryo Pasteur PipettesDarwinD2208003230 mm, Fire Polishedinstrument table<td style='overflow:nascosto;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> DZ202012010 Microscopio ottico invertitoOLYMPUS IX71Iniezione di lidocaina cloridrato <td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>H310210725 mL : 0.1 gMedical balanceShanghai Guangzheng Medical Instrument Co., LTD201609-4854JYT-2Maschere chirurgiche medicheDistretto di Guangzhou City Panyu Fabbrica di materiali sanitari Haozheng16122032817.5×9.5 cm(dimensioni aperte 17.5×17 cm)Tavolo operativo motorizzato Shandong Mingtai Medical Equipment Co., LTDYZB0089-2011tavolo operatorioMedicazione autoadesiva per feriteGuangzhou Ya Tian Biological Technology Co., LTD201421403486 cm x 7 cm(3 cm x 4 cm)Siringhe ipodermiche sterili per uso singoloShandong Weigao Group Medical polymer Products Co., LTD202309215 mL, dotato di un 0.7mm (0.7 x 32TWLB)Sterile powder free latex surgical gloveBeijing Ruijing Latex Products Co., LTD202303032271/2, 61/2Pacchetto strumenti chirurgici Dipartimento di Fornitura del Terzo Ospedale Affiliato dell'Università Sun Yat-sen10228376sterilizzazione autoclaveSurgical lightShanghai Jishun Medical Device Manufacturing Co., LTDJSL2009-160D <tr style='height:21px;'>Tabella di pulizia del flusso verticaleSuzhou Wanda Purification Technology Co., LTDDS-CZ-1311006SH-CJ-2FD-1500