Spettrometria di massa al plasma accoppiata induttivamente con ablazione laser per visualizzare i metalli nel tessuto cerebrale del topo

Abstract

Fonte: Hare, D. J., et.al. Imaging dei metalli nel tessuto cerebrale mediante ablazione laser - Plasma accoppiato induttivamente - Spettrometria di massa (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)

Questo video dimostra l'uso dell'ablazione laser-spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (LA-ICP-MS) per visualizzare e quantificare le distribuzioni di metalli nel tessuto cerebrale di topo. Il protocollo prevede l'ablazione laser per generare un aerosol di particelle campione, la ionizzazione delle particelle nel plasma ad alta temperatura e la spettrometria di massa per separare gli ioni in base ai loro rapporti massa-carica. Un software specializzato viene quindi utilizzato per generare immagini quantitative, rivelando la distribuzione spaziale dei metalli all'interno del tessuto.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Preparazione del LA-ICP-MS per l'analisi

1. Posizionare gli standard e il campione nella camera di ablazione, assicurandosi che rientrino nella profondità di campo della telecamera CCD montata sull'unità LA. Se è necessaria l'accordatura dello strumento, includere un materiale di riferimento adatto ( ad esempio, NIST 612 Trace Elements in Glass). Serrare a mano le due viti sullo sportello della camera per sigillare la camera di ablazione.
2. Nel software ICP-MS, selezionare l'apertura della valvola del gas argon nel pannello "Manutenzione" o simile e impostare il flusso di gas di trasporto su 1,2 L min^-1 nella finestra di dialogo appropriata.
   NOTA: In questo protocollo l'argon viene utilizzato come gas di trasporto. Diversi esempi utilizzano l'elio o una miscela di elio e argon come gas di trasporto.
3. Nel software LA, fare clic sul pulsante 'spurgo' per lavare la cella con gas argon per un minimo di 30 minuti.
   NOTA: Il tempo di spurgo può essere modificato facendo clic su un pulsante 'tempo di spurgo' o simile. Quando si utilizza un sistema di ablazione con una cella di ablazione a due volumi, spostare periodicamente il tavolino su ciascun angolo e attraversare diagonalmente la cella per garantire che la maggior quantità possibile di aria residua venga rimossa dalla cella. Ciò può essere ottenuto selezionando le "fasi iniziali" o una funzione equivalente.
4. Accendere l'ICP-MS facendo clic su "plasma on" e lasciare riscaldare per due ore, durante le quali è possibile eseguire i passaggi 1.5 - 2.4. Le impostazioni dello strumento variano a seconda del produttore.
5. Ablazione rappresentativa degli standard tissutali
   1. Seleziona lo strumento linea e disegna una singola linea di ablazione lunga circa 3 mm sulla superficie del tessuto.
   2. Impostare i parametri come segue facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla linea di ablazione nell'elenco dell'esperimento e modificando i seguenti elementi: diametro del fascio (selezionato in modo appropriato dall'utente; qui viene utilizzato un raggio quadrato di 30 μm), velocità di scansione (4 volte il diametro del fascio al secondo; 120 μm s^-1) e fluenza di energia (0,3 -0,5 J cm^-2 per i tessuti molli; ottimizzare se necessario per matrici più dure). Con uno spessore del tessuto di 30 μm, il raggio laser non penetra l'intero spessore di questo tessuto, eliminando qualsiasi potenziale contaminante dal supporto del microscopio. La normalizzazione al carbonio può essere utilizzata per correggere la variazione della quantità di tessuto ablato. Imposta questi parametri come predefiniti per ogni riga successiva selezionando il pulsante di opzione "predefinito".
   3. Duplica questa riga sei volte selezionando la riga iniziale, facendo clic con il pulsante destro del mouse e selezionando "scansioni duplicate". Assicurarsi che le linee siano sfalsate nell'asse x- o y- del diametro della trave. Questo dà un totale di sette linee per standard, distanziate tra loro in base al diametro del fascio.
   4. Ripetere i passaggi 1.5.1 - 1.5.3 per ogni standard, assicurandosi che la linea sia di identica lunghezza.
6. Per disegnare l'area di ablazione sul campione, seguire uno dei due metodi seguenti:
   NOTA: Assicurarsi che gli stessi parametri di scansione (diametro del fascio, velocità di scansione, fluenza di energia) siano utilizzati per le linee di campionamento.
   1. Se il sistema LA è dotato di un ampio campo visivo, selezionare lo strumento linea e tracciare una linea dall'angolo in alto a sinistra del campione abbastanza a lungo da coprire il campione nel punto più largo utilizzando gli stessi parametri laser descritti in 1.5. Duplicare questa scansione come descritto in 1.5.3 con le linee distanziate in base al diametro del fascio tutte le volte necessarie per garantire una copertura completa del campione.
   2. Se non è disponibile una vista a campo ampio, determinare e registrare le coordinate x e y (tipicamente mostrate sullo schermo principale come 'posizione scenica' o simili) corrispondenti agli angoli di un rettangolo che copre l'intero campione. Utilizzare queste coordinate per posizionare linee parallele di ablazione che coprono l'intera area del campione.
   3. Tracciare le linee per la scansione intermittente degli standard al più tardi dopo ~20 ore di scansione del campione ripetendo il processo descritto in 1.5. A seconda della durata della scansione del campione, questa operazione può essere necessaria più volte. Termina l'esperimento con un'ulteriore scansione degli standard.
      NOTA: Quando si determinano le coordinate x e y mentre la cella viene eliminata, la selezione delle posizioni iniziali e la calibrazione associata dell'asse modificherà le specifiche precedentemente acquisite per le coordinate x e y, mentre la differenza (cioè la lunghezza della linea) non sarà influenzata.

2. Impostazione dei metodi di acquisizione dati per l'ICP-MS

1. Per la linea standard di ablazione, dividere la lunghezza della linea per la velocità della scansione laser per determinare il tempo totale di analisi per una singola linea. Ripetere l'operazione per la linea di campionamento.
2. Nel software ICP-MS, creare un nuovo metodo (mostrato qui come "batch") e assicurarsi che sia selezionata l'opzione "analisi risolta nel tempo" o equivalente. Selezionare i valori m/z da rilevare, quindi regolare il tempo di integrazione per ogni m/z in modo che il tempo di integrazione totale per un ciclo sia uguale a 0,25 s. Fare clic su "Salva batch con nome" e assegnare un nome di conseguenza (, ad esempio, Std1).
   NOTA: Poiché il campione attraverserà il raggio laser a quattro volte il diametro del raggio, ciò garantisce che venga registrato un punto dati per ogni massa equivalente al diametro del raggio. Ad esempio, utilizzando una dimensione dello spot di 100 μm, una velocità di scansione di 400 μm s^-1 con un tempo di integrazione di 0,25 s produrrà immagini con dimensioni di pixel reali. Il tempo di integrazione può essere regolato per migliorare la sensibilità; Quando si aumenta il tempo di integrazione a 0,33 s, la velocità di scansione deve essere rallentata a tre volte il diametro del raggio.
3. Per gli standard, inserire il tempo di analisi per ogni scansione lineare nell'apposita casella, più altri 15 s per tenere conto dei tempi di riscaldamento e lavaggio del laser. Immettere un elenco di esecuzioni di esempio (, ovvero , l'ordine in cui vengono eseguite le scansioni) con lo stesso numero di acquisizioni (tipicamente numerate in sequenza; cioè 001, 002, ecc.) come numero totale di righe standard.
4. Per il campione, duplicare il metodo utilizzato per gli standard salvando il metodo o il batch corrente con un nome file alternativo e regolare il tempo di acquisizione totale (inclusi i 15 s aggiuntivi) e il numero totale di acquisizioni in modo che corrispondano al numero di linee che ablano il campione.
   NOTA: Poiché la maggior parte dei sistemi LA-ICP-MS utilizza un trigger unidirezionale (LA triggers ICP-MS), è essenziale che il software ICP-MS sia in attesa del trigger dal LA prima che inizi la successiva linea di ablazione. La finestra di acquisizione ICP-MS indicherà "in attesa di avvio".

3. Esecuzione dell'esperimento

1. Avvia la coda ICP-MS aggiungendo il primo metodo o batch alla coda e assicurati che il software sia in attesa del trigger dal sistema LA.
2. Nel software LA, abilitare l'alimentazione laser facendo clic su "emissione", fare clic su "esegui" e impostare il tempo di riscaldamento del laser su 10 s e il tempo di washout su 20 s nelle caselle appropriate.
   NOTA: Questo sovraccarico assicurerà che l'ICP-MS sia pronto per iniziare ad acquisire nuovi dati quando il laser inizia ogni successiva linea di ablazione.
3. Avvia la sequenza laser facendo clic su "Avvia". Se si utilizza una cella a due volumi, assicurarsi che la coppa del campione sia in posizione.

4. Calcolo degli standard di quantificazione

NOTA: Esistono diverse varianti per la conversione dei dati ICP-MS in immagini. Questi includono l'uso di strumenti software fatti in casa scritti in linguaggi open source, macro commerciali e software di analisi dei dati. In questo caso, utilizza il plug-in software sviluppato di recente, basato su una suite specializzata di analisi dei dati LA-ICP-MS.

1. Trasferisci tutte le cartelle batch contenenti i dati di esecuzione (001.d, 002.d, ecc.) su un computer separato con il software di analisi installato. Estrarre i file di dati *.csv per ogni riga del batch in una cartella separata.
   NOTA: L'uso di uno script per trasferire automaticamente i file *.csv in una nuova cartella è altamente raccomandato. Per ulteriori dettagli, vedere il codice Python allegato. Questo script è stato scritto per adattarsi a un ICP-MS Agilent serie 7700 o 8800, ma può essere modificato per adattarsi al file di output di altri produttori.
2. Apri la piattaforma software e segui le schede in sequenza per importare e analizzare gli standard per produrre immagini quantitative come descritto di seguito.
3. Per importare i dati dal primo batch standard, selezionare "Agilent .csv" per "Tipo di file", "Intera cartella" per "Tipo di importazione" e verificare che il "Formato data" sia identico al formato del computer. Fare clic su 'Importa', selezionare la cartella contenente i file di .csv per la prima serie di standard e passare alla scheda 'Linee di base'.
4. Sottrazione di base
   1. Utilizzare la scheda 'Selezioni automatiche' (comando 2) dal menu a discesa principale dell'applicazione nella barra degli strumenti, selezionare 'Informazioni dall'importazione' e fare clic su 'Continua'.
   2. Fai clic su "Seleziona tutto" e seleziona "Baseline_1" per l'integrazione.
   3. Per selezionare i primi 10 s di ciascuna linea di scansione (corrispondenti al tempo di riscaldamento del laser), ritagliare i dati inserendo i secondi valori '0' e '(durata della linea - 10 s)' e fare clic su 'Aggiungi integrazioni' (ad esempio, per una linea di scansione di 35 s, inserire i valori '0' e '25').
5. Per selezionare i dati di esempio, utilizzare la scheda 'Selezioni automatiche' come descritto in 4.4, ma scegliere 'Output_1' come integrazione. Ritaglia i dati dall'inizio e dalla fine di ogni riga standard per escludere il segnale di fondo (es. per una linea di scansione di 35 s, inserisci i valori '13' e '4').
6. Per escludere cali di segnale causati da possibili buchi negli standard, nella scheda 'Campioni', fare clic su 'Canali' in alto a sinistra dell'area del grafico per selezionare un canale con un elevato rapporto segnale/rumore ( ad esempio, C13 o P31). Prendere nota di eventuali cali bruschi nel segnale e selezionare un valore CPS sufficientemente basso che sia inferiore alla normale variazione all'interno dei campioni, ma abbastanza alto da evidenziare i cali bruschi nel segnale.
7. Fare clic sulla scheda "DRS" e selezionare "Baseline_Subtract" per il "Current Data Reduction Scheme". Scegliere il canale da 4.6 per 'Index Channel' e il valore CPS per 'Soglia da utilizzare quando si mascherano i segnali bassi'. Inserire un valore <0,5 s per "Secondi per tagliare prima/dopo i segnali bassi" per tenere conto del ritardo nel trasferimento del segnale dal laser all'ICP-MS.
8. Per confermare un adeguato mascheramento delle aree a basso segnale, fare clic sulla scheda 'Campioni' e selezionare una traccia del canale elaborata (, ad esempio ., Fe56_CPS). Ripetere e perfezionare i valori CPS e "Secondi per tagliare prima/dopo i segnali bassi" come in 4.7, se necessario.
9. Fai clic sulla scheda "Risultati" e scegli "Esporta dati" dal menu a discesa principale dell'applicazione. Inserisci un nome file per generare un file di dati del foglio di calcolo dei risultati (, ad esempio, , calcoli Std1, Std2...).
10. Aprire il file di dati in un apposito foglio di calcolo e calcolare i valori CPS per ogni singolo canale da quantificare. Utilizzare le concentrazioni di metalli predeterminate dalla nebulizzazione in soluzione ICP-MS per calcolare il fattore di conversione dai valori CPS in ppm (μg g⁻¹) per ciascun elemento quantificabile.
11. Ripetere i passaggi 4.3 - 4.10 per tutti i set di standard nella seduta.

5. Costruzione di immagini quantitative

1. Scrivi 'Biolite()' nel prompt dei comandi per aprire il software.
2. Importa i dati di esempio facendo clic su "Carica immagini" e selezionando la cartella contenente i file di .csv per l'immagine di esempio.
3. Correzione dello sfondo
   1. Fai clic sulla scheda 'Baseline' per applicare la correzione dello sfondo al campione. Nell'immagine al fosforo (P31) visualizzata sullo schermo, selezionare le aree dello sfondo utilizzando lo strumento di disegno rettangolare. La selezione del maggior numero possibile di regioni crea una mappa dell'intera immagine della deriva del segnale/plasma per garantire un'adeguata compensazione da questi fattori confondenti.
   2. Per rendere più visibile il segnale di sfondo, selezionare lo strumento di modifica del grafico (in alto a sinistra dell'immagine visualizzata) e fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine. Seleziona 'Modifica aspetto immagine' e cambia il 'Primo colore a Z=' in un valore negativo grande (es. -100.000). Procedi facendo clic su "Fine".
4. Fare clic sulla scheda "Standard" per visualizzare una tabella per i fattori di correzione CPS/ppm. Immettere i valori calcolati in base agli standard del passaggio 4.10 per ciascuno degli elementi. Questo passaggio aiuterà a correggere la deriva della sensibilità nell'ICP-MS. Fai clic su "Vai!"
5. Apri "Browser dati" dalla scheda "Dati", che contiene le immagini per ogni elemento e ogni passaggio.
6. Per finalizzare un'immagine per l'esportazione, selezionare l'immagine desiderata nella cartella 'StdCorrImages', fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome dell'immagine (*_ppm) e fare clic su 'NewImage'. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine per aprire "Modifica aspetto immagine" per scegliere la tabella dei colori e la scala di colori desiderate. Aggiungi una scala di colori all'immagine facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e selezionando "Aggiungi annotazione". Seleziona "Scala colori" dal menu a discesa in alto a sinistra e utilizza le schede per modificare la scala di colori desiderata.
7. Per esportare un'immagine, assicurati che l'immagine in questione sia selezionata e vai alla scheda "File" e fai clic su "Salva grafica...". Selezionare il formato desiderato e salvare l'immagine. In alternativa, l'immagine selezionata può essere trasferita utilizzando gli strumenti di copia e incolla.
8. Ripetere i passaggi 5.6 e 5.7 per tutte le immagini di interesse.
9. Quantificare le regioni discrete
   1. Per attivare gli strumenti ROI, vai alla scheda 'Analisi', 'Pacchetti' e seleziona 'Elaborazione immagini'.
   2. Seleziona l'immagine desiderata e vai alla scheda "Immagine" e fai clic su "ROI...". Fai clic su "Avvia disegno ROI" e utilizza uno strumento di disegno per selezionare una regione di interesse nel campione. Per terminare il disegno, fai clic su "Termina ROI".
   3. Per acquisire le statistiche per il ROI selezionato, vai alla scheda "Immagine" e fai clic su "Statistiche...".
   4. Copia e incolla i risultati in un foglio di calcolo separato. Ripetere la selezione del ROI (5.9.2) per tutte le regioni e gli elementi di interesse.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrini per microscopio in vetro di soda	n/a	n/a	I vetrini tipici sono adatti a tutti gli esperimenti
NWR213 Sistema di ablazione laser	ESI Ltd	n/a	Utilizzato in questi esperimenti. Altri produttori adatti, potrebbero richiedere modifiche al protocollo
Agilent 8800 Series ICP-MS	Agilent Technologies	n/a	Utilizzato in questi esperimenti. Altri produttori adatti, potrebbero richiedere modifiche al protocollo
Iolite	Iolite Software	n/a	Disponibile da http://iolite-software.com/. Sono disponibili altri metodi, vedi protocollo
Excel	Microsoft	n/a
IGOR Pro	Wave Metrics	n/a	Disponibile da https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm