Imaging a bioluminescenza per valutare la crescita tumorale in una fetta di cervello di topo organotipico

Abstract

Fonte: Ciraku, L., et. al. Un modello di fetta cerebrale ex vivo per studiare e mirare alla crescita del tumore metastatico cerebrale del cancro al seno. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video mostra l'imaging di cellule tumorali che esprimono luciferasi in una fetta di cervello di topo organotipico. La luciferina viene aggiunta al terreno e la piastra viene posizionata all'interno della camera del sistema di imaging in vivo. I parametri per l'acquisizione delle immagini vengono regolati e vengono definite la forma e le dimensioni del tumore. I segnali bioluminescenti emessi dalle cellule tumorali vengono quindi registrati.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

Nota: in questo studio sono stati utilizzati topi femmina atimici Nu/Nu (6-8 settimane).

1. Iniezione intracranica di cellule tumorali

1. Sterilizzare tutte le attrezzature (pinzette, forbici, forbici per sutura, trapano a mano) con un ciclo a secco di un'autoclave per un massimo di 45 minuti in buste di sterilizzazione, incluso un indicatore di sterilizzazione. Se gli interventi chirurgici vengono condotti su più animali, sterilizzare gli strumenti tra gli animali utilizzando uno sterilizzatore a perline riscaldato (fino a 3 volte).
2. Anestetizzare i topi secondo il protocollo di cura degli animali degli utenti (ad es. isoflurano (4% per induzione, 1-2% di mantenimento) e somministrare analgesia (sottocutanea, 0,1 ml di 0,1 mg/kg di buprenorfina SR-LAB) prima dell'inizio dell'intervento chirurgico. Garantire una profondità ottimale dell'anestesia con un pizzico di punta.
3. Posiziona i mouse in un telaio stereotassico e immobilizza la testa utilizzando le barre auricolari standard (Figura 1A). Quindi, applicare un unguento oftalmico sugli occhi.
4. Sterilizzare la superficie della testa mediante applicazione ripetuta e alternata (3x) di tamponi di iodio ed etanolo al 70% prima dell'incisione.
5. Usa un bisturi chirurgico per praticare un'incisione della linea mediana di 1 cm attraverso la pelle con un angolo leggermente diagonale rispetto alla linea immaginaria che divide il cervello del topo in due metà simmetriche per esporre il cranio. Asciugare il sangue con un batuffolo di cotone.
6. Deviare la pelle lateralmente per esporre il sito di iniezione: 2 mm a destra, 1 mm in avanti rispetto al bregma +2 mediolaterale (+2ML), +1 rostrale/caudale (+1RC).
7. Utilizzare una punta a fresa (0,73 mm) per penetrare nel cranio +2ML, +1RC fino al bregma e praticare un foro esercitando una leggera pressione e un movimento di torsione.
8. Utilizzare una siringa per iniezione cerebrale per iniettare 5 μL di 100.000 cellule MDA-MB-231BR (proteina fluorescente verde o GFP-Luciferasi)/μL in soluzione salina sterile 1x tampone fosfato (PBS) inserendo inizialmente la siringa a 3,5 mm di profondità nel cervello.
9. Lasciare riposare la siringa per 2 minuti. Tirarla verso l'alto di circa 1 mm e, dopo 2 minuti, iniettare lentamente la prima metà del volume.
10. Attendere altri 2 minuti prima di iniettare il resto, quindi tirare lentamente la siringa 3 minuti dopo l'iniezione finale. nota: L'iniezione lenta è empirica nel consentire al volume di essere ben assorbito dal tessuto cerebrale e di non creare perdite dopo aver tirato la siringa, il che può portare alla crescita di cellule tumorali al di fuori del sito previsto.
11. Applicare la cera ossea sul sito di iniezione sul cranio e quindi utilizzare suture in polipropilene per suturare il tessuto. I topi si riprenderanno entro 5 minuti dalla rimozione dell'anestesia.
12. Monitorare il loro comportamento subito dopo l'intervento chirurgico per circa 10 minuti, 3 ore dopo e il giorno successivo per determinare se è necessario un trattamento speciale, tra cui iniezione di soluzione salina, cibo morbido, ecc., per aiutare con un rapido recupero.
13. Monitorare la crescita del tumore tramite l'imaging a bioluminescenza sul sistema di imaging.
    1. Per questo, per prima cosa, attiva l'ossigeno e l'isoflurano nel sistema di imaging. Lasciare che entrambi vengano distribuiti in una camera separata all'esterno della scatola di imaging.
    2. Quindi, accendi il software, inizializza lo strumento e scegli l'opzione appropriata per visualizzare e catturare l'intero corpo del mouse.
14. Metti i topi in una camera separata con isoflurano e assicurati una profondità di anestesia ottimale con un pizzico per le dita dei piedi. Iniettare i topi per via intraperitoneale con 200 μL di luciferina 30 mg/mL.
15. Trasferire lo stomaco dei topi verso il basso nella presa di risonanza della camera di imaging fornita di ossigeno e isoflurano. Bloccare la camera e scegliere un tempo di esposizione di 2 minuti per avviare l'imaging.
16. Utilizzare lo strumento ROI (region of interest) del software per quantificare il segnale bioluminescente del tumore.
17. Per analizzare le dimensioni del tumore, scegli lo strumento forma cerchio per adattarlo alla forma e alle dimensioni del tumore. Misura il ROI e riporta le letture totali.
18. Lasciare crescere il tumore solido per 12-14 giorni (o fino a quando la luciferasi raggiunge circa 7,0 x 10⁶ unità) (Figura 1B) prima di generare fette di cervello. nota: Aumentare il numero di cellule da iniettare porterà a una crescita più rapida del tumore; Pertanto, la generazione di fette di cervello può avvenire prima di 12 giorni. D'altra parte, un tumore più grande porterà a più fette di GFP+ se lasciato crescere per 14 giorni. Dopo 14 giorni, la salute dei topi inizia a deteriorarsi rapidamente; Pertanto, il monitoraggio della salute degli animali dovrebbe essere aumentato a una volta al giorno dopo il periodo di 10 giorni e tutti i topi che mostrano segni di dolore e/o disagio dovrebbero essere utilizzati per generare le fette.

2. Generare fette di cervello

NOTA: Eseguire i passaggi dopo l'isolamento cerebrale in una cappa a flusso laminare sterile. In genere è possibile generare 35-40 singole fette contenenti cellule tumorali (segnale della luciferasi) da un topo iniettato con cellule MDA-MB-231BR (Figura 1C).

1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave. Posizionare l'affettatrice nella cappa sterile a flusso laminare e pulire tutti gli strumenti con etanolo al 70%.
2. Dopo 12-14 giorni dall'iniezione intracranica di cellule MDA-MB-231BR, anestetizzare i topi secondo il protocollo di cura degli animali dell'utente come descritto in 1.2. Garantire una profondità ottimale dell'anestesia con un pizzico di punta.
3. Rimuovere e posizionare rapidamente il cervello (entro 45 s) nel liquido cerebrospinale artificiale saccarosio ghiacciato (4 °C) o nel saccarosio-ACSF composto da: 280 mM di saccarosio, 5 mM di cloruro di potassio (KCl), 2 mM di cloruro di magnesio (MgCl₂), 1 mM di cloruro di calcio (CaCl₂), 20 mM di glucosio, 10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico o HEPES, 5 mM di sodio (Na+)-ascorbato, 3 mM di tiourea, 2 mM di Na+, 29 mM di piruvato; pH=7,3.
4. Usando un bisturi affilato e sterile o una lama di rasoio, taglia via le parti in eccesso del cervello che non contengono alcun tumore da tutti i lati, compresa la parte inferiore del cervello.
5. Porta la forma del cervello a un cubo non perfetto da posizionare piatto sulla carta da filtro bagnata ACSF su un coperchio per piatti da 60 mm per facilitare l'affettatura. nota: Il tessuto extra del cervello in cui è improbabile che il tumore sia cresciuto viene rimosso prima dell'affettatura per consentire la generazione di fette per lo più GFP+ e creare una forma del cervello che sia stabile sulla superficie dello strumento e non sarà disturbata dalle vibrazioni causate dall'affettatura.
6. Posizionare diversi fogli di cerchi di carta da filtro pre-bagnati (con ACSF) sulla piattaforma di taglio e posizionare il tessuto bloccato sopra di essa.
7. Impostare la dimensione del taglio sullo strumento su 2 o 2,5 unità sul righello in dotazione per tagliare il tessuto in sezioni da 200-250 μm. nota: Sono praticabili fette fino a 350 μm o sottili fino a 100 μm. Per fette <200 μm, utilizzare un vibratomo o un compresso.
8. Usa un pennello (zibellino) per trasferire le fette di cervello in un piatto contenente saccarosio ACSF e separa le fette al microscopio ottico usando aghi da 27 G.
9. Identificare le fette GFP-positive al microscopio a fluorescenza e trasferirle in un nuovo piatto da 60 mm contenente 2-3 mL di terreno di coltura per adulti (terreno neurobasale A, 2% di B12, 1% di N2, 1% di glutammina, 0,5% di glucosio, 10 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina) utilizzando una pipetta sterile da 1 mL rotta (apertura larga). nota: Sono escluse le fette di cervello che contengono cellule tumorali che crescono sulla superficie cerebrale (forse a causa di perdite di cellule per iniezione, ecc.).
10. Trasferire 3-5 fette su ciascun inserto di coltura tissutale da 30 mm e pori di 0,4 μm in piastre a 6 pozzetti a una distanza tale da non consentire la crescita l'una nell'altra.
11. Rimuovere il terreno in eccesso dalla superficie dell'inserto utilizzando una pipetta P1000, aggiungere 1 mL di terreno per fette di topo adulto sotto ciascun inserto ed equilibrare il terreno nell'incubatore prima dell'affettamento.
12. Incubare i tessuti a 37 °C, 5% di CO₂ e 95% di umidità per 24 ore prima dell'imaging.

3. Imaging delle fette con sistema di imaging in vivo (IVIS)

NOTA: Eseguire le fasi di aggiunta della luciferasi e dell'inibitore in una cappa a flusso laminare sterile.

1. Pipettare 5 μL di soluzione di luciferina da 30 mg/mL nel terreno sotto gli inserti, sollevando l'inserto con una pinza e rimettendoli nel pozzetto dopo l'aggiunta di luciferina al terreno nel pozzetto.
2. Posizionare la piastra a 6 pozzetti con il coperchio all'interno della camera di imaging dello strumento sotto la telecamera fissa e bloccare lo sportello della camera.
3. Aprire il software e inizializzare lo strumento.
4. Scegli le impostazioni della fotocamera che consentono la visualizzazione e l'acquisizione di un solo pozzetto per immagine. Spostare il tavolino verso l'alto (campo visivo o FOV di 5 cm) e posizionare il pozzetto che deve essere ripreso direttamente sotto la telecamera.
5. Impostare il tempo di imaging su più appropriato a seconda dell'intensità della luciferasi che il tumore emetterà, che può variare da 10 s a 5 min. Iniziare impostandolo a 10 s e poi aumentare se il segnale è basso, ma mantenerlo costante per tutti i punti temporali e le condizioni fino alla fine dell'esperimento (Figura 1D).
6. Usa lo strumento ROI (strumento a forma di cerchio), adattalo alla forma e alle dimensioni del tumore, misura il ROI e riporta le letture totali per quantificare il segnale bioluminescente di ciascun tumore sulla fetta.

Risultati

Figura 1. Iniezione intracranica, generazione di fette di cervello e crescita di BCBM ex vivo. (A) Rappresentazione schematica di un topo durante l'iniezione intracranica sotto uno strumento stereotassico. (B) Immagini rappresentative del r...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1mL siringa, punta scorrevole	BD	309659
30 aghi G1/2 BD		305106
piastre a 6 pozzetti	Genessee	25-105
Microscopio automatizzato e software LUMAVIEW	Etaluma	LS720
B27 (GEM21)	Gemini Bio-Products	400-160
Becher 50 mL	Fisher	10-210-685
Pennello smussato zibellino, Misura #5/0	Microscopia elettronica Sciences	66100-50
Cera ossea	ModoMed	DYNJBW25
Siringa	per iniezione cerebraleHamilton Company	80430
CaCl₂	Fisher Scientific	BP510-250
D-luciferina sale di potassio	Perkin Elmer	122799
Lama di rasoio a doppio taglio	VWR	55411-060 (95-0043)
Carta da filtro , cerchi quantitativi, 4,25 cm	Fisher	09-805a (1001-042)
Pennello di zibellino fine #2/0	Scienze della microscopia elettronica	66100-20
Pinze	Strumenti di scienza fine	11251-20
Glucosio	Sigma Aldrich	G8270
Glutammina (200 mM)	Corning cellgrow	25-005-CL
Set di trapani manuali con punte elicoidali Micro Mini Amazon		YCQ2851920086082DJ
HEPES, acido libero	Fisher Scientific	BP299-1
Solo per topi Stereotaxic Frame	Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA).	72-6049, 72-6044
KCl	Fisher Scientific	S271-10
Forbici chirurgiche grandi	Strumenti di scienza fine	14001-18
Cellule MDA-MB-231BR	Gentilmente fornito dalla dott.ssa Patricia Steeg	Ref 14
MgCl₂·6H₂O	Fisher Scientific	M33-500
Dispositivo di imaging per topi	Perkin Elmer	IVIS 200 system
Software di imaging per topi	Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA).	Living Image Software
Lettore di micropiastre	Tecan Spark
Soluzione di montaggio	Invitrogen	P36935
Reagente MTS	Promega CellTiter 96 Aquoous One Solution	(Cat:G3582)
Integratore di N2	Life Technologies	17502-048
Medium neurobasale	Life Life Tecnologie	21103049
Topi atimici Nu/Nu	Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)
Paraformaldeide	Affymetrix	19943
Pen/Strep	Life Technologies	145140-122
Sutura in polipropilene	Fornitura Medex	ETH-8556H
Tampone di iodio povidone bastoni	DME Supply USA	Cat: 689286X
Lama per bisturi #11 (confezione da 100)	Fine Science Tools	10011-00
Manico per bisturi #3	Fine Science Tools	10003-12
Piruvato di sodio	Sigma Aldrich	S8636
Spatola/sonda	Fine Science Tools	10090-13
Lame di rasoio non rivestite a doppio taglio SS (American safety razor co (95-0043))	VWR	55411-060
Saccarosio	Amresco	57-50-1
Bisturi chirurgico	Exelint International	D29702
Trinciatessuto	Brinkman	(tipo McIlwain)
Inserti per colture tissutali	Millipore	PICMORG50 o PICM03050