Imaging di seconda generazione armonica in un modello di ratto per studiare i difetti della tubulina

Abstract

Fonte: Piazza, V., et al., Ottica non lineare senza etichetta per lo studio dei difetti dipendenti dalla tubulina nella mielina centrale. J. Vis. Exp. (2023)

Questo video mostra la procedura per l'imaging delle anomalie dei microtubuli in una fetta di tessuto cerebrale di ratto utilizzando un microscopio a eccitazione a due fotoni. Impiega segnali di seconda armonica (SHG) per rilevare i difetti della tubulina e la ridotta produzione di mielina.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Trasferire al microscopio

1. Se il microscopio si trova in un'altra stanza, preparare una scatola isolante con impacchi di gel riscaldati per trasferire le sezioni di tessuto mantenendo la temperatura. La scatola manterrà anche le sezioni calde fino a quando non vengono riprese.
2. Mettere il campione sotto il microscopio e assicurarsi che sia posizionato correttamente sotto l'obiettivo mediante osservazione diretta attraverso gli oculari a luce trasmessa.
   NOTA: L'obiettivo è quello di allineare le strutture di emissione previste con la direzione di oscillazione del laser per massimizzare il segnale di generazione di seconda armonica (SHG) emesso (e, quindi, rilevato).
3. Rimuovere l'HBSS in eccesso in modo che una sottile pellicola liquida copra l'intero campione. Controllare visivamente il film liquido ogni pochi minuti per evitare un'eccessiva evaporazione e asciugatura del campione.
   NOTA: Nelle condizioni descritte, una sezione viene utilizzata per non più di 20 minuti. L'essiccazione del campione provoca drastici effetti artefatti (Figura 1A). Se sono necessari tempi di imaging più lunghi, si consiglia di immergere periodicamente la sezione in un mezzo caldo e fresco piuttosto che aggiungere più HBSS. L'uso di camere di perfusione e colla o agarosio a basso punto di fusione per immobilizzare il tessuto è raccomandato anche quando si devono fare esperimenti più lunghi.
4. Preparare il tavolino del microscopio per l'imaging non descanned, che potrebbe includere la chiusura di tutte le porte della camera di incubazione scura o la copertura della camera di incubazione con un tessuto rivestito in nylon rivestito di poliuretano nero.

2. Imaging

1. Selezionare la modalità di imaging "non descansionata" lungo il percorso di trasmissione. In questo modo, la cattura del debole segnale SH della tubulina sarà ottimizzata.
2. Seleziona l'obiettivo LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
3. Impostare una potenza del laser compresa tra 13 mW e 26 mW, con un tempo di permanenza dei pixel di 12,6 μs. Scatta immagini non più grandi di 512 pixel x 512 pixel, con una velocità di 5 e una media di 2, per un tempo medio di acquisizione di circa 15 s.
   NOTA: L'uso di potenze laser più elevate e/o tempi di permanenza più lunghi può danneggiare il campione (Figura 1B).
4. Scatta prima le immagini utilizzando un filtro passa-corto da 485 nm (SP485) e, in una seconda fase, aggiungi un filtro passa-banda nitido da 405 nm (BP405; Figura 2).
   NOTA: Le immagini pseudo-campo chiaro possono essere scattate attraverso lo stesso rivelatore utilizzando la luce laser residua di una linea visibile (i laser a 405 nm o 488 nm funzionano meglio).

Risultati

Figura 1: Esempi di artefatti. (A) Artefatto dovuto all'essiccazione del campione. (B) Artefatto dovuto a un'esposizione eccessiva. Barre di scala: 30 μm.

Materiali