Imaging confocale time-lapse della dinamica dendritica neuronale negli espianti di retina di topo

Abstract

Fonte: Ing-Esteves, S. & Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Powder Cell Populations. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video dimostra l'uso della microscopia confocale per visualizzare le dinamiche dendritiche negli espianti retinici di topi vivi. Delinea i passaggi per stabilizzare la retina sotto un microscopio confocale, eseguire l'imaging in epifluorescenza per visualizzare gli interneuroni amacrini starburst e acquisire immagini 3D time-lapse per monitorare i cambiamenti nella morfologia dendritica amacrina.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Imaging confocale time-lapse di preparazioni retiniche a montaggio intero dal vivo

1. Assemblare la camera di incubazione per imaging dal vivo per un microscopio confocale verticale, come mostrato in Figura 1.
   NOTA: Per i sistemi confocali invertiti, i supporti piatti sono posizionati con le cellule gangliari retiniche (RGC) rivolte verso il basso direttamente sul vetrino coprioggetti inferiore della camera di incubazione. Una volta che le retine entrano in contatto con il vetrino coprioggetti, non possono essere spostate.
2. Riempire la camera con liquido cerebrospinale artificiale ossigenato (aCSF) e accendere la pompa e il regolatore di temperatura (temperatura 32-34 °C, portata 1 mL/min). Non lasciare che la temperatura superi i 34 °C.
3. Per trasferire la retina a montaggio piatto nella camera di perfusione, arrestare la pompa e rimuovere l'aCSF che si trova nella camera. Posizionare il disco di estere di cellulosa misto (MCE) con la montatura piatta retinica nella camera di incubazione (vuota).
4. Posizionare un peso del campione sul montaggio piatto; Pre-bagnare il peso per rompere la tensione superficiale. Riempire la camera con l'aCSF riscaldato e far circolare l'aCSF a ~1 mL/min.
5. Posizionare il revolver con l'obiettivo a immersione in acqua 25x (apertura numerica 0,95) nella camera di imaging. Screening per le cellule marcate di interesse utilizzando la luce epifluorescente (Figura 1C).
6. Regolare il volume dell'immagine per acquisire le caratteristiche dendritiche di interesse.
   NOTA: Questo studio ha catturato l'intero albero dendritico a 1024 x 1024 pixel per fotogramma, passo z di 1 μm e un frame rate di 2 minuti tra ogni z-stack. Le dimensioni finali dell'immagine sono ~100 μm x 100 μm x 20 μm.
7. Per regolare la potenza del laser su un'impostazione ottimale, utilizzare una tabella di ricerca che identifichi sia i pixel sovrasaturi che quelli sottosaturi. Durante la scansione, regolare la potenza del laser in modo che nessun pixel sia sovrasaturo (ad esempio, a un'intensità di 255 o superiore). Continuare l'imaging per tutto il tempo necessario o fino a quando non si verifica un calo significativo e rilevabile del segnale fluorescente e un aumento del rumore (in genere 2-4 ore).
   NOTA: Si raccomanda una potenza laser ridotta poiché gli algoritmi di deconvoluzione funzionano in modo ottimale quando i pixel sono distribuiti sull'intera gamma dinamica. L'intensità dei pixel non deve superare i 254; Le analisi empiriche dei neuriti hanno rivelato che valori di pixel inferiori a 170 sono ideali per la deconvoluzione. Le velocità di scansione elevate (400-600 Hz) con media delle linee (2-3) sono preferibili a scansioni singole e più lente dello stesso tempo di permanenza totale dei pixel. L'area di imaging prolungato spesso fotosbianca, ma altre sezioni di espiantazione rimangono vitali. È possibile visualizzare più regioni in una montatura piatta, ciascuna per 2-4 ore, con un tempo di incubazione totale di 6 ore. Le sessioni di imaging oltre le 6 ore non sono state testate sistematicamente. La degradazione della neurite e il blebbing sono segni che la vitalità dell'espianto è in declino.

Risultati

Figura 1: Configurazione della camera di incubazione per l'imaging di cellule vive. (A) Apparecchio di incubazione con imaging dal vivo che mostra componenti di riscaldamento, soluzione e imaging. Il doppio riscaldatore include una piattaform...

Materiali