Imaging e quantificazione della rigenerazione assonale nei neuroni del ganglio retinico di ratto assotomizzati

Abstract

Fonte: Portela-Lomba, M., et. al. Cocoltura di neuroni gangliari retinici di ratto assotomizzati con glia inguainante olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assonale adulta. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video dimostra l'imaging e la quantificazione della rigenerazione assonale in neuroni gangliari retinici di ratto axotomizzati (RGN) co-coltivati con cellule gliali di rivestimento olfattivo umano immortalizzate. Gli RGN sono immunomarcati, con soma rossi e assoni verdi. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio a epifluorescenza e la percentuale di neuroni con un indice di rigenerazione assonale e assonale è stata quantificata utilizzando un software di imaging.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Coltura di glia con guaina olfattiva umana (ihOEG, Ts12 e Ts14)

NOTA: Questa procedura viene eseguita in condizioni sterili in una cappa di biosicurezza per colture tissutali.

1. Preparare 50 ml di terreno di coltura ME10 OEG.
2. Preparare 5 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium o DMEM/F12-Fetal Bovine Serum (FBS), in una provetta conica da 15 mL.
3. Scaldare entrambi i terreni a 37 °C in un bagno di acqua pulita per 15 minuti.
4. Scongelare i flaconcini di cellule Ts12 e Ts14 a 37 °C in un bagno di acqua pulita.
5. Risospendere e aggiungere le cellule al terreno di coltura DMEM/F12-FBS preparato nella fase 2.
6. Centrifugare per 5 minuti a 200 x g.
7. Aspire il surnatante.
8. Aggiungere 500 μl di terreno ME10 e risospendere il pellet.
9. Preparare una piastra per colture cellulari p60 con 3 mL di ME10 e aggiungere la sospensione cellulare goccia a goccia.
10. Muoversi per distribuire le celle in modo uniforme sulla piastra.
11. Colture cellulari a 37 °C in CO₂.
    NOTA: Dopo aver raggiunto la confluenza, deve essere fatto almeno un altro passaggio per ottimizzare le cellule per la cocoltura. È necessaria una confluenza del 90% prima di seminarli sui vetrini coprioggetti per la cocoltura. Un p-60 confluente ha un numero medio di celle di 7 x 10⁵ per Ts14 e 2,5 x 10⁶ per le linee cellulari Ts12. Le linee cellulari Ts12 e Ts14 devono essere fatte passare ogni 2-3 giorni.

2. Preparazione dell'ihOEG (Ts12 e Ts14) per il test

NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito 24 ore prima della dissezione e della cocoltura dei neuroni gangliari retinici (RGN).

1. Trattare i vetrini coprioggetti da 12 mm Ø con 10 μg/mL di poli-L-lisina (PLL) per 1 ora.
   NOTA: I vetrini coprioggetti possono essere lasciati per una notte nella soluzione PLL.
2. Lavare i vetrini coprioggetti con 1 tampone fosfato salino (PBS) tre volte.
3. Staccare le cellule ihOEG Ts12 e Ts14 dalla piastra di coltura cellulare p60.
   1. Aggiungere 4 mL di terreno di coltura DMEM/F12-FBS a una provetta conica da 15 mL. Scaldare a 37 °C in un bagno d'acqua pulita.
   2. Rimuovere il terreno dalle piastre e lavare le cellule una volta con 1 mL di acido 1x PBS-etilendiamminotetraacetico (EDTA).
   3. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA alle cellule OEG e incubare per 3-5 minuti a 37 °C, 5% CO₂.
   4. Raccogliere le cellule con una pipetta p1000 e trasferirle nel terreno preparato al punto 3.1.
   5. Centrifugare per 5 minuti a 200 x g.
   6. Aspire il surnatante.
   7. Aggiungere 1 mL di terreno ME10 e risospendere il pellet.
   8. Contare il numero di cellule in un emocitometro.
4. Seminare 80.000 cellule Ts14 o 100.000 cellule/pozzetto sui vetrini coprioggetti in piastre a 24 pozzetti in 500 μL di terreno ME10.
5. Colture di cellule a 37 °C in CO al 5% ₂ per 24 h.

3. Dissezione del tessuto retinico

NOTA: I ratti Wistar maschi di 2 mesi sono utilizzati come fonte di RGN. Due retine (un ratto) per 20 pozzetti di una capsula cellulare da 24 pozzetti. Autoclavare il materiale chirurgico prima dell'uso. Il kit per la dissociazione della papaina è acquistabile in commercio (Tabella dei materiali). Seguire le istruzioni del fornitore per la ricostituzione. Ricostituire l'acido D, L-2-ammino-5-fosfonovalerico (APV) in 5 mM e preparare le aliquote.

1. Il giorno del test, preparare i seguenti terreni.
   1. Preparare una piastra per colture cellulari p60 con 5 ml di soluzione salina bilanciata di Earle fredda o EBSS (fiala 1 del kit di dissociazione della papaina).
   2. Preparare una piastra per colture cellulari p60 con la fiala ricostituita 2 (papaina) del kit di dissociazione della papaina più 50 μl di APV. Quindi, aggiungere 250 μl di flaconcino 3 ricostituito (DNasi più 5 μl di APV).
   3. In una provetta sterile, mescolare 2,7 mL di flaconcino 1 con 300 μL di flaconcino 4 (inibitore dell'albumina-ovomucoide proteasi). Aggiungere 150 μL di flaconcino 3 (DNasi) più 30 μL di APV.
   4. Preparare 20 mL di terreno Neurobasal-B27 (NB-B27).
2. Sacrifica un ratto per asfissia con CO₂.
3. Togliere la testa per decapitazione con una ghigliottina; metterlo in una capsula di Petri da 100 mm e spruzzare la testa con etanolo al 70% prima di metterla in una cappa a flusso laminare.
4. Taglia i baffi del topo con le forbici in modo che non interferiscano con la manipolazione degli occhi.
5. Afferra il nervo ottico con una pinza per estrarre il bulbo oculare abbastanza da poter praticare un'incisione attraverso l'occhio con un bisturi.
6. Rimuovere il cristallino e l'umor vitreo ed estrarre la retina (tessuto simile all'arancia), mentre gli strati rimanenti dell'occhio rimangono all'interno (compreso lo strato epiteliale pigmentato).
7. Posizionare la retina nella piastra di coltura cellulare p60 preparata al punto 3.1.1.
8. Trasferire la retina nella piastra di coltura cellulare p60 preparata al punto 3.1.2 e tagliarla con il bisturi in piccoli pezzi di dimensioni approssimative < 1 mm.
9. Trasferire in una provetta di plastica da 15 mL.
10. Incubare il tessuto per 30 minuti in un incubatore umidificato a 37 °C sotto il 5% di CO₂, con agitazione ogni 10 minuti.
11. Dissociare i grumi cellulari pipettando su e giù con una pipetta di vetro Pasteur.
12. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 minuti.
13. Eliminare il surnatante e, per inattivare la papaina, risospendere il pellet cellulare nella soluzione preparata al punto 3.1.3. (1,5 ml per 2 occhi).
14. Pipettare con cura questa sospensione cellulare in 5 mL di flaconcino ricostituito 4.
15. Centrifugare a 200 x g per 5 min.
16. Durante la centrifugazione, rimuovere completamente il terreno ME-10 dalla piastra di celle OEG a 24 pozzetti (precedentemente preparata nella fase 2) e sostituirlo con 500 μl di terreno NB-B27 per pozzetto.
17. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 2 mL di terreno NB-B27.
18. Piastra 100 μL di sospensione di cellule retiniche, per pozzetto della piastra m24, su vetrini coprioggetti trattati con PLL o monostrati OEG.
19. Mantenere le colture a 37 °C con il 5% di CO₂ per 96 ore in terreno NB-B27.

4. Immunocolorazione

1. Dopo 96 ore, fissare le cellule per 10 minuti aggiungendo lo stesso volume di paraformaldeide (PFA) al 4% in 1x PBS al terreno di coltura (600 μL) (concentrazione finale di PFA 2%).
2. Rimuovere il terreno e il PFA dalla piastra a 24 pozzetti e aggiungere nuovamente 500 μl di paraformaldeide (PFA) al 4% in 1x PBS. Incubare per 10 min.
3. Scartare il fissatore e lavare 3 volte con 1x PBS per 5 min.
4. Bloccare con 0,1% Triton X-100/1% FBS in PBS (PBS-TS) per 30-40 min.
5. Preparare gli anticorpi primari nel tampone PBS-TS come segue: Anticorpo monoclonale SMI31 (contro le proteine MAP1B e NF-H) (1:500). 514 (riconosce le proteine MAP2A e B) antisiero policlonale di coniglio (1:400).
6. Aggiungere gli anticorpi primari alle cocolture e incubare per una notte a 4 °C.
7. Il giorno successivo, scartare gli anticorpi e lavare i vetrini coprioggetti con 1x PBS, 3 volte, per 5 min.
8. Preparare gli anticorpi secondari nel tampone PBS-TS come segue: Per SMI-31, anti-topo Alexa Fluor 488 (1:500). Per 514, Alexa-594 anti-coniglio (1:500).
9. Incubare le cellule con i corrispondenti anticorpi secondari fluorescenti per 1 ora, a temperatura ambiente o RT al buio.
10. Lavare i vetrini coprioggetti con 1x PBS, 3 volte, per 5 minuti, al buio.
11. Infine, montare i vetrini coprioggetti con il mezzo di montaggio (Tabella dei materiali) e mantenerli a 4 °C.
    NOTA: Quando necessario, può essere eseguita la colorazione fluorescente dei nuclei con DAPI (4,6-diamidino-2-fenilidolo). Prima del montaggio, incubare le cellule per 10 minuti al buio con DAPI (10 μg/mL in 1x PBS). Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con 1x PBS e, infine, montare i vetrini coprioggetti con il mezzo di montaggio.

5. Quantificazione della rigenerazione assonale

NOTA: I campioni vengono quantificati sotto l'obiettivo 40x di un microscopio a epifluorescenza. Devono essere scattate un minimo di 30 immagini su campi casuali, con almeno 200 neuroni, da quantificare per ogni trattamento. Ogni esperimento deve essere ripetuto almeno tre volte.

1. Quantificare la percentuale di neuroni con assone (neurite SMI31 positivo) rispetto alla popolazione totale di RGN (identificati con l'immunocolorazione positiva MAP2A/B 514 del corpo neuronale e dei dendriti).
2. Quantificare l'indice di rigenerazione assonale o la lunghezza assonale, media (μm/neurone). Questo parametro è definito come la somma delle lunghezze (in μm) di tutti gli assoni identificati, divisa per il numero totale di neuroni contati, indipendentemente dal fatto che abbiano presentato un assone o meno. La lunghezza assonale viene determinata utilizzando il plugin NeuronJ del software di immagini ImageJ (NIH-USA).
3. Calcola la media, la deviazione standard e la significatività statistica utilizzando il software appropriato.

Materiali