Imaging cellulare mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale

Abstract

Fonte: Daniele, F., et. al Sonde TIRFM e GFP sensibili al pH per valutare la dinamica delle vescicole dei neurotrasmettitori nelle cellule di neuroblastoma SH-SY5Y: imaging cellulare e analisi dei dati. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video mostra l'imaging di cellule di neuroblastoma umano utilizzando un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per visualizzare vescicole sinaptiche marcate con fluorofori. Le cellule vengono prima focalizzate in modalità epifluorescenza. Vengono quindi effettuate regolazioni per ottenere una riflessione interna totale, generando onde evanescenti che eccitano selettivamente i fluorofori vicino alla membrana. Prima dell'imaging TIRF, vengono configurati i parametri di acquisizione e viene impostata la frequenza di campionamento.

Protocol

1. Coltura cellulare e trasfezione

1. SH-SY5Y coltura cellulare
   NOTA: Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando il neuroblastoma umano SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266). Le cellule SH-SY5Y crescono come una miscela di cluster galleggianti e cellule aderenti. Seguire le istruzioni riportate nel protocollo (densità cellulare, rapporto di scissione, ecc.) per avere cellule che crescono saldamente attaccate alla copertura di vetro, che è fondamentale per la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM).
   1. Prima di iniziare, sotto la cappa di biosicurezza a flusso laminare, prepara il volume opportuno di soluzione salina tampone fosfato sterile (PBS) e terreno di coltura.
      1. Preparare 50 ml di PBS con concentrazioni di 150 mM di cloruro di sodio (NaCl), 24 mM di tampone fosfato, pH 7,4. Filtra la soluzione.
      2. Preparare 50 ml di terreno cellulare dal terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco con glucosio elevato, siero fetale bovino (FBS) inattivato termicamente al 10%, penicillina (100 U/ml), streptomicina (100 μg/ml), L-glutammina (2 mM) e piruvato di sodio (1 mM). Filtra la soluzione.
   2. Rimuovere l'intero terreno di coltura e lavare le cellule con 3 ml di PBS.
   3. Incubare le cellule con 2 ml di acido tripsin-etilendiammin-tetraacetico allo 0,05% (EDTA) (per una piastra di Petri da 6 cm) per 5 minuti a 37 °C, 5% di CO₂ e staccare le cellule utilizzando una pipetta.
   4. Inattivare la tripsina aggiungendo 2 ml di DMEM e raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min.
   5. Rimuovere il surnatante, aggiungere 1 ml di DMEM al pellet e pipettare la soluzione su e giù a sufficienza per disperdere le cellule in una sospensione unicellulare.
   6. Dividerli 1:4 in una nuova piastra Petri di 6 cm di diametro contenente 3 ml di terreno completo. Mantenere le cellule in coltura in piastre di Petri di 6 cm di diametro a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂. Sottocoltura una volta alla settimana, o quando hanno coperto l'80-90% della superficie.
2. Placcatura delle celle SH-SY5Y per l'imaging
   1. Per gli esperimenti TIRFM, le celle delle piastre sono posizionate su coperture di vetro. Utilizzare coperture in vetro con spessore 0,17 ± 0,005 mm e indice di rifrazione 1,5255 ± 0,00015. Prima di iniziare, prepara i vetrini coprioggetti come segue:
      1. Pulisci i coperchi di vetro con etanolo al 90% durante la notte (O/N).
      2. Sciacquarli accuratamente in acqua distillata (tre cambi di acqua distillata). Asciugare i coperchi di vetro in un forno di essiccazione.
      3. Mettere i coperchi in piastre di Petri di vetro e sterilizzare in forno preriscaldato a 200 °C per 3 ore.
   2. Il giorno prima della trasfezione, porre ogni vetrino coprioggetti in una capsula di Petri da 3,5 cm, aggiungere 1 ml di terreno di coltura e incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂
   .
   3. Tripsinizzare le cellule come descritto nei passaggi 1.1.3 - 1.1.5, sospendere il pellet cellulare in 1 ml di terreno completo e contare. Calcolare il volume corretto di sospensione cellulare da aggiungere a ciascuna piastra di Petri per ottenere 3 x 10⁵ cellule/pozzetto. Questa densità è necessaria per una crescita cellulare ottimale e una trasfezione efficiente. Incubare a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ O/N.
3. SH-SY5Ytransfezione mediante polietilenimmina (PEI)
   NOTA: Per visualizzare la dinamica delle vescicole sinaptiche, è stato utilizzato un vettore pCB6 contenente sinapto-pHluorina. La sinapto-pHluorin è stata generata dalla fusione in-frame di una variante sensibile al pH della proteina fluorescente verde (GFP) e della proteina di membrana vescicolare sinaptobrevina 2. Il costrutto è stato ampiamente impiegato per studiare le proprietà delle vescicole sinaptiche all'interno dei neuroni.
   1. Prima di iniziare la trasfezione, crea 10 ml delle seguenti soluzioni. Conservare le soluzioni per un massimo di 1 mese.
      1. Crea una soluzione NaCl da 150 mM. Regolare a pH 5,5 con acido cloridrico (HCl) 0,01 N.
      2. Preparare una soluzione di PEI al 10% di polietilenimmina (PEI; 25 kDa lineare) in 150 mM di soluzione di NaCl. Il pH della soluzione sale a 8,8. Regolare il pH a 7,8 con 0,01 N HCl.
   2. 24 ore dopo la placcatura, rimuovere il terreno e rinfrescare con 1,5 ml di terreno completo. Conservare le celle a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂.
   3. Sotto la cappa di biosicurezza a flusso laminare, in una provetta per microfuge da 1,5 ml, aggiungere 3 μg di DNA plasmidico a 25 μl di soluzione di NaCl 150 mM e 100 μl di soluzione PEI per piastra di Petri da 3,5 cm.
   4. Agitare per 10 secondi, quindi incubare la miscela DNA/PEI per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
   5. Aggiungere con cautela la miscela DNA/PEI alla piastra di Petri contenente vetrini coprioggetti con cellule e agitare delicatamente per distribuire uniformemente il reagente nella piastra di Petri.
   6. Dopo 4 ore, cambiare il terreno e incubare le cellule O/N a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂. Eseguire esperimenti di imaging 24 - 48 ore dopo la trasfezione.

2. Imaging cellulare tramite TIRFM

1. Imaging set-up
   1. Esegui l'imaging TIRF con la configurazione descritta nella Figura 1. Comprende un microscopio invertito motorizzato (Figura 1, riquadro A), la sorgente laser (Figura 1, riquadro B) e il cursore TIRF (Figura 1, riquadro C). Raggiungi l'illuminazione TIRFM attraverso un'elevata apertura numerica (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) 100X olio, obiettivo ad immersione.
   2. Per l'illuminazione TIRFM, utilizzare un laser agli ioni di argon multilinea (458/488/514 nm) da 100 mW. Utilizzando una fibra monomodale, introdurre la luce laser polarizzata linearmente nel percorso del raggio tramite il cursore TIRF. Inserire il cursore TIRF nel piano del diaframma del campo luminoso del percorso del fascio di luce riflessa.
      1. Per l'illuminazione a campo largo, collega il microscopio a una lampada convenzionale ad arco corto al mercurio HBO a luce bianca. Un doppio prisma che mantiene la polarizzazione nel cursore assicura la combinazione simultanea di illuminazione TIRF e luce bianca.
   3. Filtrare la luce laser con un filtro di eccitazione (larghezza di banda 488/10 nm) montato su una ruota portafiltri e introdotto nel percorso del laser. Utilizza un otturatore ad alta velocità controllato da software per consentire un controllo rapido dell'illuminazione laser. Per l'analisi della pHluorin, montare un filtro di emissione passa-banda 525/50 nm. Acquisizione di immagini digitali (512 x 512 pixel) su una telecamera CCD veloce raffreddata con il software Image ProPlus.
2. Ottenere l'illuminazione TIRF (Figura 2)
   1. Accendi i laser, il computer, la fotocamera, la ruota portafiltri e i controller dell'otturatore; quindi, attendi 20 minuti prima di iniziare l'esperimento poiché i laser devono riscaldarsi e stabilizzarsi.
   2. Prima dell'imaging, effettuare il volume opportuno delle seguenti soluzioni.
      1. Prepara 50 ml di soluzione di Krebs (KRH) a 125 mM di NaCl, 5 mM di cloruro di potassio (KCl), 1.2 mM di solfato di magnesio (MgSO₄), 1.2 mM di fosfato monobasico di potassio (KH₂PO₄), 25 mM di acido 4-(2-idrossietil) piperazina-1-etansolfonico (HEPES) (tamponato a pH 7.4), 2 mM di cloruro di calcio (CaCl₂) e 6 mM di glucosio.
      2. Preparare 10 ml di soluzione di KCl-KRH (pH 7,4) a 80 mM di NaCl, 50 mM di KCl, 1,2 mM di MgSO₄, 1,2 mM di KH₂PO₄, 25 mM di HEPES (tamponato a pH 7,4), 2 mM di CaCl₂ e 6 mM di glucosio.
   3. Rimuovere il coperchio di vetro con le celle trasfettate e inserirlo nell'apposita camera di imaging. Assemblare la camera e aggiungere 500 μl di soluzione di KRH al centro del vetro.
   4. Aggiungere olio sull'obiettivo. Posizionare la camera di imaging sul tavolino del microscopio e posizionare l'obiettivo sotto il vetrino coprioggetti. Posizionare il coperchio di sicurezza sul campione.
   5. In modalità epifluorescenza, concentrarsi sul vetrino coprioggetto (superficie superiore) e scegliere le cellule trasfettate posizionate al centro della camera. Selezionare le celle il cui segnale fluorescente può essere registrato chiaramente utilizzando un tempo di esposizione inferiore a 80 msec.
   6. Sotto il controllo del software, passare all'illuminazione TIRF in modalità live.
   7. Per impostare la configurazione TIRF, controllare la posizione del raggio che fuoriesce dall'obiettivo sul coperchio del campione (Figura 2B). Quando il raggio è posizionato al centro della lente dell'obiettivo (Figura 2A, a sinistra), è visibile una macchia al centro del coperchio del campione TIRF (Figura 2B, a sinistra) e la cellula viene ripresa in modalità epifluorescenza (diversi piani di messa a fuoco, alta fluorescenza di fondo; Figura 2C, a sinistra).
   8. Per raggiungere l'angolo critico, spostare il punto messo a fuoco in direzione Y (avanti o indietro; Figura 2B, al centro) utilizzando la vite di regolazione dell'angolo sul cursore TIRF (Figura 1C). Quando il raggio converge sul piano del campione con un angolo maggiore dell'angolo critico (Figura 2A, a destra), la macchia scompare e al centro del coperchio del campione è evidente una linea diritta, sottile e focalizzata (Figura 2B, a destra).
   9. Per regolare con precisione l'angolo TIRF, utilizzare il campione di cella (Figura 2C). Guarda l'immagine a fluorescenza nel video. In questa fase, un'immagine simile all'epifluorescenza è ancora visibile. Muovere delicatamente la vite fino a raggiungere la condizione TIRF: solo un piano ottico della cella è a fuoco (cioè la membrana plasmatica a contatto con il vetrino coprioggetti). Ciò si traduce in un'immagine piatta con un contrasto elevato (Figura 2C, a destra).
3. Esempio di imaging
   1. Imposta l'esperimento time-lapse a canale singolo. Per ridurre al minimo il fotosbiancamento, acquisire l'immagine utilizzando un tempo di esposizione basso e un guadagno elevato. I tempi di esposizione appropriati sono compresi tra 40 e 80 msec. Acquisizione di immagini con frequenza di campionamento di 1 - 2 Hz. La cinetica delle vescicole può essere più apprezzata nel campionamento a frequenze più elevate (10 Hz). Il tempo di osservazione regolare è solitamente di 2 minuti.

Results

Figura 1. Microscopio TIRF impostato. Vista schematica e immagine (riquadro) del sistema di microscopio TIRF. La configurazione comprende il microscopio invertito motorizzato Axio Observer Z1 (A), un laser multilinea agli ioni di argon da 1...

Materials