Imaging cellulare mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale

Abstract

Fonte: Daniele, F., et. al Sonde TIRFM e GFP sensibili al pH per valutare la dinamica delle vescicole dei neurotrasmettitori nelle cellule di neuroblastoma SH-SY5Y: imaging cellulare e analisi dei dati. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video mostra l'imaging di cellule di neuroblastoma umano utilizzando un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per visualizzare vescicole sinaptiche marcate con fluorofori. Le cellule vengono prima focalizzate in modalità epifluorescenza. Vengono quindi effettuate regolazioni per ottenere una riflessione interna totale, generando onde evanescenti che eccitano selettivamente i fluorofori vicino alla membrana. Prima dell'imaging TIRF, vengono configurati i parametri di acquisizione e viene impostata la frequenza di campionamento.

Protocol

1. Coltura cellulare e trasfezione

1. SH-SY5Y coltura cellulare
   NOTA: Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando il neuroblastoma umano SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266). Le cellule SH-SY5Y crescono come una miscela di cluster galleggianti e cellule aderenti. Seguire le istruzioni riportate nel protocollo (densità cellulare, rapporto di scissione, ecc.) per avere cellule che crescono saldamente attaccate alla copertura di vetro, che è fondamentale per la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM).
   1. Prima di iniziare, sotto la cappa di biosicurezza a flusso laminare, prepara il volume ....

Results

Figura 1. Microscopio TIRF impostato. Vista schematica e immagine (riquadro) del sistema di microscopio TIRF. La configurazione comprende il microscopio invertito motorizzato Axio Observer Z1 (A), un laser multilinea agli ioni di argon da 1.......

Materials