Imaging cellulare mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale

Abstract

Fonte: Daniele, F., et. al Sonde TIRFM e GFP sensibili al pH per valutare la dinamica delle vescicole dei neurotrasmettitori nelle cellule di neuroblastoma SH-SY5Y: imaging cellulare e analisi dei dati. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video mostra l'imaging di cellule di neuroblastoma umano utilizzando un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per visualizzare vescicole sinaptiche marcate con fluorofori. Le cellule vengono prima focalizzate in modalità epifluorescenza. Vengono quindi effettuate regolazioni per ottenere una riflessione interna totale, generando onde evanescenti che eccitano selettivamente i fluorofori vicino alla membrana. Prima dell'imaging TIRF, vengono configurati i parametri di acquisizione e viene impostata la frequenza di campionamento.

Protocollo

1. Coltura cellulare e trasfezione

1. SH-SY5Y coltura cellulare
   NOTA: Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando il neuroblastoma umano SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266). Le cellule SH-SY5Y crescono come una miscela di cluster galleggianti e cellule aderenti. Seguire le istruzioni riportate nel protocollo (densità cellulare, rapporto di scissione, ecc.) per avere cellule che crescono saldamente attaccate alla copertura di vetro, che è fondamentale per la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRFM).
   1. Prima di iniziare, sotto la cappa di biosicurezza a flusso laminare, prepara il volume ....

Risultati

Figura 1. Microscopio TIRF impostato. Vista schematica e immagine (riquadro) del sistema di microscopio TIRF. La configurazione comprende il microscopio invertito motorizzato Axio Observer Z1 (A), un laser multilinea agli ioni di argon da 1.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Attrezzatura
Axio Observer Z1	Zeiss	491912-9850-000	invertito microscopehttp://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction
77	Lasos	00000-1312-752	multilinea (458/488/514 nm), 100mW argon-ion laserhttp://www.lasos.com/products/argon-ion-laser
Laser TIRF cursore	Zeiss	423681-9901-000	http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html
100x Objective	Zeiss	421190-9900-000	Oil, NA 1.45 Alpha-Planhttps://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=o&a=v&m=a& id=421190-9900-000&ss=1
CCD Camera RetigaSRV Fast 1394	QImaging		http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf
LAMBDA 10-3 cambio filtro ottico con SmartShutter	Sutter Instrument Company		http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html
Software
Image ProPlus 6.3 Software	Media Cybernetics		selezione spot, Selezione ROI, intensità della fluorescenza determinationhttp://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP
Excel	Microsoft		Correzione del fotosbiancamento, analyseshttp://office.microsoft.com/it-it/excel/ di cellule intere e vescicole singole
GraphPad Prism 4.00	GraphPad Software, Inc.		statistica analysishttp://www.graphpad.com/scientific-software/prism/