Microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per la visualizzazione di eventi esocitici

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Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonte: Winkle, C. C., et al. Utilizzo di metodologie combinate per definire il ruolo del rilascio della membrana plasmatica durante la ramificazione degli assoni e la morfogenesi neuronale. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) per la visualizzazione di eventi esocitici nei neuroni corticali. Un marcatore di proteina fluorescente verde (GFP) sensibile al pH emette fluorescenza dopo la fusione delle vescicole, con eccitazione TIRF selettiva che cattura l'esocitosi prossimale della membrana nell'imaging time-lapse.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Imaging di eventi esocitici tramite microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Nota: questo protocollo richiede apparecchiature di microscopia specializzate, tra cui una camera ambientale per mantenere la temperatura, l'umidità e l'anidride carbonica (CO_{2 2}), un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale invertita (TIRF) dotato di illuminazione epifluorescente, un obiettivo TIRF ad alto ingrandimento/alta apertura numerica (NA), un XYZ automatizzato stadio e un rivelatore con dispositivo sensibile ad accoppiamento di carica (CCD). Questo protocollo utilizza un microscopio invertito completamente automat....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm con fondo in vetro piastre per l'imaging di cellule vive	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	Deve essere rivestito con poli-D-lisina da 1mg/mL e risciacquato prima di galvanizzare le celle
Microscopio invertito Olympus IX81-ZDC2	Olympus
Lambda LS lampada allo xeno	Sutter Instruments Company
Incubatore ambientale	Tokai Hit
100x 1.49 NA Obiettivo TIRF	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Cell Software di controllo TIRF	Olympus		Software utilizzato per il controllo laser per imaging TIRF
Fiji (Immagine J)	NIH	ImageJ versione 1.49t
Coniglio policlonale anti-umano VAMP2	Segnalazione cellulare	11829
Poli-D-lisina	Sigma	p-7886	Disciolto in acqua sterile a 1mg/mL

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