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1. Imaging di eventi esocitici tramite microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)
Nota: questo protocollo richiede apparecchiature di microscopia specializzate, tra cui una camera ambientale per mantenere la temperatura, l'umidità e l'anidride carbonica (CO2 2), un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale invertita (TIRF) dotato di illuminazione epifluorescente, un obiettivo TIRF ad alto ingrandimento/alta apertura numerica (NA), un XYZ automatizzato stadio e un rivelatore con dispositivo sensibile ad accoppiamento di carica (CCD). Questo protocollo utilizza un microscopio invertito completamente automatizzato dotato di un obiettivo TIRF 100x 1,49 NA, un laser a stato solido da 491 nm e un CCD a moltiplicazione di elettroni (EM-CCD). Tutte le apparecchiature sono controllate da software di imaging e controllo laser. Prima dell'inizio del protocollo di imaging, accendere la camera ambientale, il tavolino, la lampada, il computer e la fotocamera.
- Selezionare l'obiettivo all'interno del software di imaging. Una volta posizionato l'obiettivo, fissare il riscaldatore dell'obiettivo attorno al collare.
- Verificare che l'obiettivo sia completamente abbassato prima di fissare l'incubatrice del palco nello slot del palco. Versare l'acqua distillata in modo uniforme negli ingressi dell'incubatore per evitare fuoriuscite.
- Accendi il sistema di incubazione. Aprire la valvola del serbatoio di CO2 e verificare che la pressione sia appropriata per il sistema secondo le istruzioni del produttore. Lasciare che la camera raggiunga il 5% di CO2 e 37 °C. Prima di aggiungere la piastra di imaging, posizionare una capsula vuota nell'incubatore per evitare la condensa dell'acqua sull'obiettivo.
- Accendere la sorgente laser.
- Aprire l'incubatrice del tavolino e aggiungere olio da immersione alla lente. Posizionare il campione nell'incubatrice e stabilizzarlo con bracci di stabilità o un peso piatto. Sollevare l'obiettivo fino a quando l'olio non entra in contatto con il fondo del campione. Passa all'illuminazione a luce trasmessa e trova il piano focale neuronale attraverso gli oculari.
- Avviare il software del laser e collegarlo al software di controllo del laser. Impostare l'illuminazione su campo largo e selezionare l'obiettivo (si consiglia 100x 1,49 NA TIRF). Impostare l'indice di rifrazione del campione (celle ~1,38). Regolare l'intensità del laser deselezionando "TTL" (Transistor-Transistor Logic) per il laser a 491 nm. Regola il cursore su 100, quindi riportalo a un valore compreso tra il 20% e il 40%. Ricontrolla "TTL".
- Focalizzare nuovamente il campione in illuminazione a luce trasmessa. Vai al software di imaging, seleziona l'illuminazione laser a 491 nm e apri l'otturatore. Regolare con precisione il punto focale del laser sul soffitto e centrarlo al centro del diaframma a campo chiuso con il condensatore rimosso. Posizionare il condensatore capovolto sul banco ottico in modo da non graffiare la lente.
- Sostituire il condensatore, accedere al software TIRF e impostare la profondità di penetrazione (PD) su 110 nm. Quindi, passare dall'illuminazione a campo largo alla modalità di illuminazione TIRF per l'imaging.
- Trova le cellule che esprimono la proteina di membrana 2 associata alla vescicola (VAMP2) attraverso gli oculari utilizzando l'epifluorescenza a campo largo con la sorgente di luce epifluorescente.
- Regola i parametri di imaging (tempo di esposizione, guadagno e potenza laser) per massimizzare il rapporto segnale-rumore e la gamma dinamica utilizzando il tempo di esposizione minimo e l'intensità del laser per ridurre il fotosbiancamento e la fototossicità (ad esempio, esposizione tra 50 - 100 msec, con un guadagno di 15 - 30 al 30% della massima potenza laser).
- Imposta la messa a fuoco automatica continua per cella. Acquisire un set di immagini timelapse con acquisizione che avviene ogni 0,5 secondi per 5 minuti. Per la condizione di stimolazione con netrina-1, aggiungere 500 ng/ml di netrina-1 alla piastra di cellule in una cappa a flusso laminare e rimettere la piastra nell'incubatore per 1 ora prima dell'imaging.