Monitoraggio dell'espressione genica in tempo reale in fette di cervello tramite imaging tridimensionale

In questo articolo

Abstract

Fonte: Shimojo, H., et al. Imaging in bioluminescenza in tempo reale delle dinamiche di segnalazione Notch durante la neurogenesi murina. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, le colture di fette corticali di embrioni di topo transgenico vengono utilizzate per monitorare l'espressione genica attraverso l'imaging tridimensionale. Le immagini a bioluminescenza, fluorescenza e campo chiaro vengono utilizzate per visualizzare l'espressione genica in tempo reale durante la differenziazione neuronale all'interno del tessuto nativo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

Visualizzazione dell'espressione del reporter luciferasi nelle colture a fette
1. Avvia il sistema di imaging live a luminescenza prima di iniziare la dissezione. Utilizzare le seguenti condizioni per le colture di fette corticali: 40% O₂, 5% CO₂ e 37 °C.
2. Mettere l'olio da immersione sulla lente dell'obiettivo 40x. Posizionare il piatto del campione sul tavolino del microscopio. Acquisire l'immagine di prova fluorescente e impostare la posizione e il piano di messa a fuoco sulla regione di interesse sotto l'illuminazione della luce di eccitazione.
3. Eseguire l'acquisizione time-lapse mediante acquisizioni tridimensionali (luminescenza, fluorescenza e campo chiaro) per 24 ore (Figura 1F-H). Per l'acquisizione di immagini a luminescenza, utilizzare le seguenti impostazioni della fotocamera: bassa velocità di trasferimento (50 kHz), binning 2x2/4x4, tempo di esposizione 10 min/5 min. Per l'acquisizione di immagini a fluorescenza e in campo chiaro, utilizzare le seguenti impostazioni: velocità di trasferimento intermedia (1 MHz), binning 1x1 e tempo di esposizione di 100 ms.

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Risultati

Figura 1: Realizzazione delle fette corticali del telencefalo embrionale e visualizzazione della dinamica della proteina Dll1 nelle colture di fette corticali. (A) Controllo dell'espressione di EGFP utilizzando un microscopio stereoscopico a ...