Visualizzazione delle reti neurali e vascolari in un embrione di pollo

In questo articolo

Abstract

Fonte: Delalande, J., et.al. Doppia marcatura delle cellule della cresta neurale e dei vasi sanguigni all'interno di embrioni di pollo mediante innesto di tubo neurale^GFP di pollo e iniezione di colorante diI di carbocianina. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video mostra il trapianto di un tubo neurale di un donatore marcato con GFP da un embrione di pollo transgenico compatibile allo stadio corrispondente in un embrione ricevente a livello di somiti da uno a sette, seguito da una marcatura vascolare utilizzando un colorante fluorescente lipofilo. L'approccio combinato consente la visualizzazione diretta dell'embrione sotto un microscopio a stereofluorescenza, consentendo lo studio dell'integrazione del trapianto neurale e dello sviluppo della rete vascolare in ovo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Innestare il tessuto

Utilizzando una micropipetta di vetro, trasferire con cura il tubo neurale sezionato dal vetro dell'orologio all'embrione ospite. Posizionare il tubo neurale nel corretto orientamento antero-posteriore e spingere delicatamente l'espianto adiacente alla regione asportata del pulcino ospite utilizzando il microbisturi. Lasciare un piccolo frammento di ectoderma attaccato alla superficie dorsale o tagliando una piccola scalfittura per identificare l'orientamento del tubo neurale.
1. Se necessario, usa il micro-bisturi per tagliare l'espiante alla dimensione esatta della regione asportata.
Guidare delicatamente il tubo neurale nella regione ablata e posizionarlo in modo che il lato dorsale sia orientato correttamente. Utilizzare una micropipetta di vetro, montata su un tubo orale, per rimuovere il PBS e/o il liquido che circonda l'innesto. Questo aiuta i tessuti del donatore e dell'ospite ad aderire e l'innesto a stabilirsi.
Sigillare l'intera finestra con nastro trasparente largo 24 mm per evitare disidratazione e contaminazione.
Etichettare l'embrione chimerico segnandolo con una matita sul guscio dell'uovo e annotarne il numero nel libro di laboratorio. Rimetti l'uovo nell'incubatrice per un ulteriore sviluppo.

2. Iniettare DiI nei vasi sanguigni dell'embrione ospite

Al momento sperimentale desiderato (qui, 3 - 10 giorni dopo), recuperare l'embrione chimerico dall'incubatrice e rimuovere il nastro trasparente usando le forbici dritte per accedere all'embrione all'interno dell'ovulo.
Se necessario, allargare la finestra nel guscio usando le forbici. Fare attenzione a non danneggiare la membrana corioallantoidea se è attaccata al guscio, il che provocherebbe un'emorragia e comprometterebbe l'etichettatura dei vasi sanguigni.
Scegli una vena accessibile sul tuorlo assicurandoti che il flusso sanguigno sia diretto verso l'embrione. Scegliere un punto di ramificazione di una delle vene vitelline (Figura 1B, C).
NOTA: A E6.5 - E7.5, potrebbe essere necessario spostare delicatamente la membrana corioallantoidea con una pinzetta per accedere alle vene del tuorlo. Dopo E8.5, l'unica opzione è quella di iniettare in una delle vene della membrana corioallantoidea poiché, a questo stadio, la membrana corioallantoidea copre completamente l'embrione.
Rimuovere la membrana vitellina sopra il punto di iniezione scelto utilizzando due pinzette Dumont #5 strappando in direzioni opposte.
Rompere un ago di vetro estratto utilizzando un Dumont #5 e regolarne il diametro in base alle dimensioni approssimative della vena prima di caricarlo con CellTracker CM-DiI. Preparare la soluzione madre DiI a 40 μg/μl in DMSO e conservare a -20 °C. Preparare la soluzione di lavoro in saccarosio 0,3 M/PBS a una concentrazione di 4 μg/μl.
1. Aspirare tra 5 - 10 μl di DiI in saccarosio/PBS 0,3 M nell'ago utilizzando l'aspirazione con un tubo orale. Gli embrioni più vecchi potrebbero richiedere fino a 25 μl o più. A partire da E8.5, gli embrioni hanno vene più grandi e muscolose, che potrebbero dover essere tenute in posizione con un Dumont #5 prima di pugnalare con l'ago di vetro caricato con DiI.
Inserire rapidamente l'ago nella vena e soffiare costantemente con il tubo orale per consentire al DiI di unirsi lentamente al flusso sanguigno senza formare un coagulo. In alternativa, utilizzare un iniettore a pressione per l'erogazione DiI.

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Risultati

Figura 1. Iniezione endovenosa di DiI. (A) Strumenti consigliati: a) CellTracker CM-DiI drop su parafilm, b) ago per iniezione in vetro tirato, c) tubo boccale. (B) Diagramma schematico dell'iniezione endovenosa di DiI in emb...