Imaging in vitro in tempo reale della ramificazione assonale nei neuroni corticali di topo

Abstract

Fonte: Winkle, C. C., et al. Utilizzo di metodologie combinate per definire il ruolo del rilascio della membrana plasmatica durante la ramificazione degli assoni e la morfogenesi neuronale. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra una tecnica di imaging dal vivo che utilizza la microscopia a contrasto interferenziale differenziale (DIC) per osservare la ramificazione assonale in tempo reale nei neuroni corticali. I video time-lapse catturano gli effetti del trattamento con netrina-1, una molecola di segnalazione che induce esocitosi localizzata e riarrangiamenti citoscheletrici negli assoni. Questi processi avviano le protrusioni della membrana, che si sviluppano in rami assonali maturi, fornendo informazioni sullo sviluppo neuronale.

Protocollo

1. Microscopia time-lapse a contrasto interferenziale differenziale (DIC) della ramificazione degli assoni

Nota: sebbene questo protocollo utilizzi la DIC, altri metodi di microscopia a luce trasmessa possono essere utilizzati per gli stessi scopi (ad esempio: contrasto di fase).

1. A 2 giorni in vitro (DIV), posizionare una capsula di imaging con fondo di vetro contenente neuroni non trasfettati in una camera ambientale preriscaldata per mantenere un ambiente umido con il 5% di CO2 e 37 °C. Utilizzare un microscopio dotato di un Plan-Apochromat 60X, obiettivo DIC ad apertura numerica (NA) 1,4 e condensatore ad alta NA per la migliore qualità e risoluzione dell'immagine.
2. Regola il piano focale per trovare i neuroni attraverso gli oculari utilizzando l'illuminazione a luce trasmessa.
3. Utilizzando la funzione di acquisizione multi-area del software di imaging, è possibile trovare e salvare le posizioni XYZ di almeno 6 celle. Posiziona il tavolino in modo che i neuroni di interesse si adattino al campo visivo per ottenere i migliori risultati.
   1. Stimola con 250 ng/ml di netrina-1 e premi 'avvia acquisizione multi-area'. Acquisisci in sequenza le immagini in ogni posizione ogni 20 secondi per 24 ore, mettendo in pausa l'acquisizione e rimettendo a fuoco se necessario.
4. Rivedi le immagini nel software di imaging utilizzando Apps>Review Multi Dimensional Data>apri il nome del file. Identificare i rami stabili degli assoni (lunghi 20 μm) che si formano durante la sessione di imaging. Utilizzare lo strumento di disegno della linea per misurare un ramo stabile dell'assone dalla base dell'assone alla punta per assicurarsi che la qualifica di lunghezza di 20 μm sia soddisfatta.
   1. In un foglio di calcolo, registra il numero di frame dopo la stimolazione con netrina quando le sporgenze della membrana iniziano nelle aree in cui si formano successivamente i rami, così come il numero di frame dopo la stimolazione con netrin quando i rami nascenti raggiungono i 20 μm di lunghezza.
   2. Moltiplicate il numero di fotogrammi tra la sporgenza e la formazione del ramo per 20 secondi per calcolare il tempo di formazione per ramo.

Materiali