Imaging in vivo a due fotoni della dinamica microgliale nell'ippocampo del topo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Imaging cronico a due fotoni in vivo della microglia utilizzando topi CX3CR1-GFP

1. Dopo l'induzione dell'anestesia, lavare l'interno del tubo metallico con soluzione fisiologica sterile per rimuovere i detriti. Assicurarsi che l'alveo bianco dell'ippocampo sia visibile attraverso il vetro (Figura 1A) e che non vi siano complicazioni, come il sanguinamento postoperatorio.
2. Posiziona il mouse sotto il microscopio a due fotoni nei seguenti passaggi:
   1. Posiziona il mouse nel dispositivo di tenuta della testa sotto la lente dell'obiettivo del microscopio a due fotoni e sul tavolino di scansione XY motorizzato. Utilizzare un termoforo per il supporto termico. Monitorare e regolare la profondità dell'anestesia, poiché questo controllo di qualità può richiedere fino a 30 minuti. nota: Si consiglia l'obiettivo a immersione in acqua con una distanza di lavoro (WD) superiore a 3 mm e un'elevata apertura numerica (NA). Un collare di correzione della lente dell'obiettivo può migliorare la risoluzione compensando la discrepanza dell'indice di rifrazione tra il vetro e i biomateriali.
   2. Riempire d'acqua lo spazio tra il vetro e la lente dell'obiettivo, facendo particolare attenzione a evitare bolle d'aria. Se necessario, espandere l'area della piastra metallica utilizzando una pellicola di plastica, che trattiene più acqua, per coprire l'intera lente frontale dell'obiettivo.
   3. Accendere un laser pulsato a femtosecondi di lunghezza d'onda di 920 nm per l'eccitazione delle sonde fluorescenti espresse nel cervello e avviare il software di acquisizione delle immagini.
   4. Regolare la messa a fuoco sul CA1 (Cornu Ammonis 1) utilizzando il tavolino motorizzato e il sistema di messa a fuoco motorizzato. Posizionare la struttura target con la guida della fluorescenza emessa dal parenchima cerebrale e della luce riflessa dal bordo del tubo metallico sotto l'illuminazione continua del laser pulsato.
   5. Misura la profondità del parenchima cerebrale che tocca il fondo di vetro regolando la messa a fuoco con il sistema di messa a fuoco motorizzato. Confronta le profondità in diverse posizioni orizzontali per giudicare l'allineamento del fondo di vetro e del piano di imaging.
      1. Regolare l'angolazione della testa del mouse inclinando il dispositivo di supporto della testa fino a quando la parte inferiore del vetro non è impostata in modo che sia parallela al piano di imaging.
   6. Regolare il collare di correzione dell'obiettivo per ottenere la massima risoluzione alla profondità della struttura target nel CA1.
3. Controllare la qualità e l'intensità delle immagini ottenute dall'eccitazione a due fotoni dell'ippocampo (Figura 1B).
   NOTA: Il deterioramento dell'immagine indica la presenza di danni tissutali all'interno del cervello.
4. Assicurarsi che le microglia abbiano già recuperato la loro morfologia ramificata (Figura 1C).
   NOTA: I dati di imaging delle microglia indicano che sono necessarie almeno 3-4 settimane affinché le microglia tornino al loro stato basale.
5. Eseguire l'imaging in vivo in qualsiasi strato del CA1 per lo scopo particolare dell'esperimento.

Figura 1: Imaging in vivo della microglia in topi CX3CR1-GFP in fase cronica. (A) L'aspetto rappresentativo della finestra impiantata sul CA1 dorsale destro (Cornu Ammonis 1) nella fase cronica. Attraverso il fondo di vetro, le fibre bianche dell'alveo sono chiaramente osservate senza sanguinamento postoperatorio. La DHC e il LV sono parzialmente visibili rispettivamente nell'area caudomediale e nel bordo rostrolaterale. Barra della scala, 1 mm. (B) Ricostruzione 3D rappresentativa dall'imaging cronico in vivo di CA1 di un topo CX3CR1-GFP su POD 24 (larghezza: 511 μm, altezza: 511 μm, profondità: 670 μm). (C) Le immagini tipiche della microglia da (B) con morfologia ramificata completamente ripristinata sono mostrate come MIP di pile di immagini GFP con spessore di 20 μm a profondità di 100, 280 e 500 μm dalla superficie chirurgica. Barre di scala, 50 μm.