Consegna intranasale di cellule staminali mesenchimali in un modello murino di lesione cerebrale traumatica

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Marcatura di cellule staminali mesenchimali (MSC) con nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico (SPIO)

1. Per marcare le MSC con SPIO, aggiungere 6 mL di terreno di marcatura (25 μg/mL di SPIO nel terreno Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco senza siero fetale bovino (FBS)) a un pallone T75 contenente MSC (80% di confluenza).
2. Incubare le cellule con il mezzo di marcatura in un incubatore di CO₂ (37 °C, 5% CO₂ ) senza agitare. Dopo 24 ore, rimuovere delicatamente il supporto di etichettatura utilizzando una pipetta Pasteur sterile con un puntale di plastica collegato a un vuoto. Lavare le cellule monostrato 2 volte con 6 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere eventuali tracce di SPIO non internalizzato.
   1. Per determinare se le cellule sono state etichettate con successo, controlla le cellule etichettate con un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale se lo SPIO è etichettato con un fluoroforo (cioè, come quelli usati qui; Figura 1B, C).
3. Raccogliere le cellule aderenti mediante trattamento con 3 mL di tripsina e incubare a 37 °C. Dopo 5 minuti di incubazione, aggiungere 7 ml di terreno DMEM preriscaldato con il 10% di FBS (v/v) per inattivare la tripsina. Raccogliere la sospensione cellulare utilizzando una pipetta in una provetta conica da 15 mL.
4. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in PBS. Contare le cellule vitali utilizzando il colorante blu di tripano e un emocitometro.
   NOTA: Il pellet cellulare delle cellule marcate apparirà di colore scuro a causa del carico di ferro (Figura 1D). Questo protocollo è rilevante per la marcatura delle MSC e la risonanza magnetica (MRI). La procedura per l'etichettatura delle MSC è stata precedentemente ottimizzata e qui sono inclusi solo i passaggi per preparare le MSC marcate per il tracciamento in vivo, poiché il monitoraggio in vivo è l'obiettivo. Il protocollo per la coltura e l'etichettatura di altri tipi di cellule dovrebbe essere ottimizzato dal ricercatore.
5. Regolare la concentrazione cellulare utilizzando PBS a 150.000 cellule (o un numero che si traduce in un segnale MRI sufficiente) in 18 μL di PBS (o il volume totale che verrà utilizzato nella procedura di somministrazione intranasale).
   NOTA: È stato notato che una concentrazione cellulare superiore a 150.000 cellule/18 μL di PBS porta all'aggregazione cellulare, che può influire sull'efficienza della somministrazione intranasale. Se è necessario un numero maggiore di cellule per la somministrazione intranasale, aumentare il volume totale della sospensione cellulare e aumentare il numero di somministrazioni intranasali, poiché la somministrazione intranasale è una procedura non invasiva ed è possibile il dosaggio multiplo.

2. Lesione da impatto corticale controllato (CCI)

NOTA: In questo protocollo, i topi maschi C57 BL/6 (7-8 settimane di età) sono stati mantenuti in un ciclo luce/buio di 12/12 ore con accesso ad libitum a cibo e acqua.

1. Per preparare ogni topo alla lesione da CCI, somministrare il cocktail anestetizzante zolazepam (50 mg/kg) e xilazina (20 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale (i.p.) (1 ml/kg). Assicurarsi che la profondità dell'anestesia sia sufficiente in caso di mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi. In alternativa, posizionare il topo in una camera fornita con isoflurano al 2%-4% per 60 s.
2. Radere il pelo della superficie dorsale del cranio tra le orecchie utilizzando un tagliacapelli elettronico. Pulire più volte la zona rasata utilizzando un batuffolo di cotone sterile imbevuto di iodio. Usa un batuffolo di cotone imbevuto di etanolo al 70% per pulire lo iodio.
3. Posizionare il mouse anestetizzato nel telaio stereotassico e fissare il mouse utilizzando le barre auricolari e le barre per il naso. Praticare un'incisione sagittale media (circa 2,5 cm) nella pelle rasata utilizzando forbici sterili per accedere alla superficie del cranio.
4. Rimuovere il tessuto sull'osso usando un batuffolo di cotone per esporre il cranio. Pulire la superficie del cranio utilizzando un batuffolo di cotone imbevuto di perossido di idrogeno al 3% (H₂O₂) per 10 s, quindi pulirlo con un batuffolo di cotone asciutto.
   NOTA: Le suture del cranio e sia la bregma che la lambda possono ora essere facilmente identificate.
5. Identificare le coordinate scelte sulla superficie del cranio per la lesione CCI e disegnare un cerchio (4 mm di diametro) attorno alle coordinate utilizzando una matita o un pennarello appropriato.
   NOTA: In questo protocollo, le coordinate anteroposteriore (AP) -2,0 mm e mediolaterale (ML) +1,5 mm sono state utilizzate per l'induzione CCI.
6. Utilizzare un microtrapano e una fresa rotonda (0,5 mm di diametro) per assottigliare il cranio in corrispondenza del cerchio contrassegnato. Evitare di applicare pressione durante la perforazione, poiché la perforazione dell'osso può causare danni al parenchima cerebrale. Pulisci la polvere di ossa usando un batuffolo di cotone pulito e asciutto.
7. Rimuovere delicatamente il lembo osseo utilizzando una pinza sterile per esporre la dura madre mantenendola intatta. Rimuovere il mouse dal telaio stereotassico utilizzato per la preparazione pre-infortunio e posizionarlo nel telaio stereotassico del dispositivo CCI.
8. Stabilizzare la testa del mouse utilizzando le barre auricolari e le barre per il naso. Assicurarsi che la testa del mouse sia a livello in direzione rostrale-caudale e, se necessario, regolare le barre del naso.
9. Seguire le istruzioni sulla scatola di controllo per azzerare la punta dell'impattatore sulla superficie corticale esposta. Assicurarsi che la punta dell'impattatore sia allineata direttamente sopra le coordinate della corteccia desiderate per l'impatto utilizzando le rotelle di controllo X e Y sulla base dell'impattatore.
10. Impostare i parametri dell'esperimento utilizzando la scatola di controllo con una velocità di 5 m/s, un tempo di permanenza di 250 ms e una profondità di lesione di 1 mm per indurre lesioni lievi nel topo.
11. Provocare lesioni premendo il pulsante ''impatto'' sulla scatola di controllo. Tamponare qualsiasi sanguinamento che si verifica utilizzando un batuffolo di cotone sterile.
12. Rimuovere il topo dalla cornice stereotassica e chiudere l'incisione utilizzando suture chirurgiche di seta. Non utilizzare clip metalliche per chiudere il sito chirurgico, poiché il topo sarà sottoposto a un campo magnetico per la risonanza magnetica.
13. Applicare antibiotici topici (bacitracina, neomicina) sul sito chirurgico per prevenire le infezioni. Tieni il mouse sul termoforo e monitoralo attentamente durante la fase di recupero.
14. Somministrare ketoprofene (2,5 mg/kg, IP) ogni giorno per 3 giorni dopo l'intervento chirurgico, a meno che la somministrazione di ketoprofene non contraddica gli obiettivi dello studio.

3. Somministrazione intranasale

1. A 1 giorno dall'induzione della CCI, somministrare il cocktail anestetizzante zolazepam (50 mg/kg) e xilazina (20 mg/kg) tramite iniezione i.p. Assicurarsi che il mouse sia profondamente anestetizzato dalla mancanza di risposta al pizzicamento delle dita.
2. Preparare il topo per la somministrazione intranasale di MSC mediante trattamento con ialuronidasi.
   1. Afferra la collottola del topo e gira saldamente la sua schiena mentre immobilizzi il teschio. Posizionare la punta di una pipetta che contiene ialuronidasi in PBS sterile (4 U/μL) vicino alla narice del topo con un angolo di 45°.
   2. Somministrare 3 μL di sospensione di ialuronidasi in ciascuna narice. Tenere il mouse immobilizzato e rivolto verso l'alto su un pad pulito per 5 minuti. Ripetere il trattamento con ialuronidasi 4 volte (totale di 100 U di sospensione di ialuronidasi).
3. Dopo il trattamento con ialuronidasi, tenere il mouse trattato su un tampone pulito rivolto verso l'alto per 30 minuti.
4. Per rilasciare le MSC nel cervello, tenere saldamente il mouse, come descritto nel passaggio 3.2.1. Somministrare 3 μL/narice di sospensione di MSC con un intervallo di 3 s. Continuare a tenere il mouse nella stessa posizione per 30 s fino a quando le gocce di campione non sono completamente scomparse.
   NOTA: Evitare la formazione di bolle d'aria durante la somministrazione.
5. Ripetere la somministrazione con un intervallo di 2 minuti fino a 3x.
   NOTA: Il numero totale di cellule da erogare è 150.000, in modo tale che 18 μL di sospensione cellulare possano essere erogati a un dosaggio di 3 μL per ciascuna narice, 3 volte ciascuno.
6. Rimetti il topo nella sua gabbia e monitoralo attentamente fino a quando non si riprende completamente dall'anestesia.

Figura 1: Diagramma di flusso schematico del protocollo e conferma in vitro dell'adozione di SPIO da parte delle MSC. (A) Le MSC sono state incubate con SPIO per 24 ore per la marcatura. Quindi, le MSC marcate sono state consegnate in un modello murino di TBI tramite una via intranasale (IN). La risonanza magnetica in diversi punti temporali è stata eseguita per tracciare le MSC marcate. La conferma di una marcatura sufficiente delle MSC da parte di SPIO è stata ottenuta mediante (B) microscopia a fluorescenza e (C) microscopia confocale utilizzando il canale FITC poiché le nanoparticelle SPIO sono state marcate con FITC. (D) Il pellet cellulare delle MSC etichettate appariva di colore scuro a causa del carico di ferro. FITC = isotiocianato di fluoresceina; SPIO = particelle superparamagnetiche di ossido di ferro; MSCs = cellule staminali mesenchimali; MRI = risonanza magnetica; IN = intranasale; TBI = lesione cerebrale traumatica.