Imaging di transitori veloci di calcio nelle terminazioni nervose di topo mediante microscopia confocale

Abstract

Fonte: Zhilyakov, N. V. et. al., Registrazione dei transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare del topo con alta risoluzione temporale utilizzando la microscopia confocale. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video mostra la tecnica di imaging per la registrazione di transitori veloci di calcio alle terminazioni nervose utilizzando la microscopia confocale. Stimolando il nervo e catturando i cambiamenti di fluorescenza dai coloranti leganti il calcio, visualizza l'afflusso dinamico di calcio e la clearance alla terminazione nervosa, offrendo informazioni precise sull'attività sinaptica e sulla segnalazione neuromuscolare.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

Gli esperimenti sono stati eseguiti su preparazioni nervo-muscolari isolate di levator auris longus (m. LAL) dai topi BALB/C (20-23 g, 2-3 mesi di età).

1. Preparazione delle soluzioni di Ringer e di limatura

1. Preparare la soluzione di Ringer per il muscolo dei mammiferi mescolando i seguenti ingredienti: cloruro di sodio, NaCl (137 mM), cloruro di potassio, KCl (5 mM), cloruro di calcio, CaCl₂ (2 mM), MgCl₂ (1 mM), NaH₂PO₄ (1 mM), NaHCO₃ (11,9 mM) e glucosio (11 mM). Far bollire la soluzione con il 95% di ossigeno (O₂) e il 5% di anidride carbonica (CO₂) e regolare il suo pH a 7,2-7,4 aggiungendo acido cloridrico/idrossido di sodio (HCl/NaOH) se necessario.
2. Preparare la soluzione di caricamento del colorante.
   1. Prepara una soluzione di acido (4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanesulfonico (HEPES) (10 mM) con pH nell'intervallo 7.2-7.4. 500 μg di colorante commerciale arrivano in una fiala da 500 μL. Sciogliere il colorante in 14 μl della soluzione HEPES per ottenere una concentrazione di colorante di 30 mM. Agitare bene e centrifugare fino a completo scioglimento.
   2. Diluire la soluzione dell'indicatore Ca²⁺ con la soluzione HEPES fino a una concentrazione di 1 mM. Conservarlo in congelatore (-20 °C) ed evitare l'esposizione alla luce.

2. Procedura di caricamento del colorante

NOTA: La procedura di caricamento del colorante viene eseguita secondo il protocollo per il caricamento attraverso il moncone nervoso, adattato dai protocolli precedentemente pubblicati.

1. Sezionare il muscolo LAL secondo la procedura di dissezione per questa preparazione come descritto nei protocolli precedentemente pubblicati.
   1. Fissare il tessuto leggermente allungato (non più del 30% rispetto alla lunghezza iniziale) nella piastra di Petri rivestita di elastomero con perni sottili in acciaio inossidabile e aggiungere la soluzione di Ringer fino a coprire completamente il muscolo.
      NOTA: La piastra di Petri è stata pre-riempita con elastomero secondo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali).
2. Preparare la pipetta di riempimento
   1. Utilizzando un estrattore per micropipette (vedi Tabella dei materiali), preparare una micropipetta con una punta sottile che sia il più affilata possibile per le registrazioni intracellulari. Utilizzare capillari senza filamenti interni (1,5 mm di diametro esterno e 0,86 o 1,10 mm di diametro interno).
   2. Rompere la punta della micropipetta dopo aver inciso la conicità con un abrasivo, lasciando la punta aperta a circa 100 μm di diametro. Lucidare a fuoco la punta verso il basso fino a limitare quando il diametro interno si restringe da >80 μm a 12-13 μm. Collegare un tubo di silicone su un lato della pipetta di riempimento e una siringa (senza ago) sull'altro lato.
3. Sotto uno stereomicroscopio, trova il punto in cui il tronco nervoso si trasforma in rami nervosi separati. Posizionare la pipetta di riempimento con il tubo montato e la siringa sulla piastra di Petri utilizzando la cera. Spostare la punta della pipetta fino a quando non si trova sopra il nervo.
4. Con le forbici sottili, tagliare il nervo vicino alla fibra muscolare, lasciando un piccolo pezzo del moncone nervoso lungo circa 1 mm. Aspirare delicatamente il moncone nervoso insieme a un po' di soluzione di Ringer, senza pizzicarlo, nella punta della pipetta di riempimento. Rimuovere il tubo di silicone dalla pipetta di riempimento.
5. Aspirare una certa quantità di soluzione caricante il colorante (~0,3 μL) utilizzando una siringa con un filamento lungo. Questo volume corrisponde a circa 3 cm di filamento.
   NOTA: Inizialmente, è necessario creare un filamento da un puntale di pipetta con un volume di 10 μl tirando il fuoco utilizzando una lampada ad alcool o un bruciatore a gas.
6. Inserire delicatamente la punta del filamento con la soluzione di caricamento nella pipetta di riempimento. Rilasciare la miscela direttamente sul moncone nervoso. Incubare il preparato a temperatura ambiente al buio per 30 min.
7. Successivamente, sciacquare il preparato con una soluzione fresca di Ringer e incubare a 25 °C per un massimo di 2 ore in un becher di vetro con 50 ml (o più) di soluzione di Ringer (il preparato deve essere coperto con la soluzione). Durante questo periodo, il colorante raggiungerà le sinapsi.

3. Acquisizione video con microscopia confocale

NOTA: La registrazione dei transitori di calcio viene eseguita con un microscopio confocale a scansione laser (LSCM) (vedi Tabella dei materiali). Per registrare i transienti veloci di calcio, è stato utilizzato un protocollo originale che consentiva registrazioni di segnali con una risoluzione spaziale e temporale sufficiente. Il microscopio era dotato di un obiettivo a immersione in acqua 20x (apertura numerica (NA) 1,00). La linea laser a 488 nm è stata attenuata al 10% di intensità e la fluorescenza di emissione è stata raccolta da 503 a 558 nm.

1. Montare il preparato nella camera sperimentale rivestita di elastomero siliconico e fissarla, leggermente allungata, con una serie di micro-aghi in acciaio. Sciacquare accuratamente la preparazione con la soluzione di Ringer.
   NOTA: È stata utilizzata una semplice camera sperimentale di perfusione su misura in vetro organico con il fondo della camera ricoperto da un elastomero (preparato secondo le istruzioni del produttore; vedi Tabella dei materiali). La camera ha un tubo di alimentazione della soluzione. La soluzione viene pompata tramite un ago per siringa, montato su un supporto magnetico (vedi Tabella dei materiali). Come camera sperimentale, poteva essere utilizzata una capsula di Petri (come quella utilizzata per l'incubazione del preparato), ma con annessi tubi di alimentazione e di aspirazione.
2. Installare un elettrodo di aspirazione, che verrà utilizzato per stimolare il nervo.
   NOTA: Posizionare e fissare l'elettrodo cerandolo accanto al bagno. Avvicinare la punta al moncone nervoso e aspirarla nell'elettrodo.
3. Montare la camera di preparazione sul tavolino del microscopio e posizionare i raccordi di ingresso e uscita nella camera.
4. Per perfondere la preparazione, utilizzare un semplice sistema a flusso di gravità. Accendere la pompa di aspirazione per perfusione per rimuovere la soluzione in eccesso.
5. Collegare l'elettrodo di aspirazione stimolante a uno stimolatore elettrico e assicurarsi che si verifichino contrazioni muscolari dopo la stimolazione. Vedere le sezioni 3.9-3.12 per le condizioni di stimolazione e la registrazione.
6. Riempire il sistema di perfusione con la soluzione di Ringer con d-tubocurarina (10 μM).
   NOTA: Questa soluzione aiuta a prevenire le contrazioni muscolari. I bloccanti specifici della D-tubocurarina o dell'alfa-bungarotossina dei recettori nicotinici dell'acetilcolina sulla membrana postsinaptica bloccherebbero completamente o parzialmente le contrazioni muscolari50. Inoltre, per prevenire le contrazioni muscolari, potrebbero essere utilizzati bloccanti specifici dei canali postsinaptici del sodio come la μ-conotossina GIIIB51.
7. Accendere la pompa di aspirazione per perfusione e avviare la perfusione del preparato con la soluzione di Ringer contenente d-tubocurarina.
8. Impostare i parametri di imaging nel software LSCM come segue.
   1. Nel software LSCM (LAS AF; vedi Tabella dei Materiali), scegli Elettrofisiologia.
      NOTA: In questa modalità, quando un'immagine viene catturata nel punto temporale, un impulso di sincronizzazione viene inviato allo stimolatore con l'aiuto della scatola di attivazione. Ciò suscita la generazione di potenziale d'azione nella preparazione (Figura 1; unità stimolatrice).
   2. Selezionare Modalità di acquisizione. Per attivare lo stimolatore utilizzando l'impulso di sincronizzazione del microscopio, nelle impostazioni del menu Lavoro, selezionare le impostazioni di attivazione. Impostate il campo Trigger Out On Frame sul canale out1.
   3. Utilizzare le seguenti impostazioni: Modalità di scansione: XYT, Frequenza di scansione: 1400 Hz, Fattore di zoom: 6.1, Foreo: completamente aperto. Assicurarsi che la modalità X bidirezionale di passaggio sequenziale sia attiva.
   4. Impostare il tempo minimo per formare un fotogramma a 52 ms e i fotogrammi da raccogliere in un video raw a 20 fotogrammi.
      NOTA: Queste impostazioni consentono l'acquisizione di immagini con una risoluzione di 128 x 128 pixel durante l'acquisizione di un singolo fotogramma ogni 52 ms.
   5. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione del laser ad argon a 488 nm con l'8% della potenza di uscita.

Premi il pulsante Modalità Live per passare alla modalità Live, che aiuta a ottenere un'anteprima dei terminali nervosi caricati con il colorante.

9. Unità di stimolazione
   NOTA: Questo dispositivo consente di impostare i parametri temporali di stimolazione tramite il software MATLAB.
   1. Crea un nuovo file, incolla il codice dall'articolo sopra menzionato nella finestra del codice MatLab e salva il file. Fare clic su Esegui, in modo che appaia una finestra con i parametri di stimolazione. Impostare il tempo di ritardo e la durata dello stimolo.
      NOTA: Il ritardo determina la risoluzione temporale del segnale fluorescente ricostituito. L'impulso elettrico della durata di 0,2 ms viene ritardato e quindi inviato all'unità di isolamento. Quest'ultimo forma l'ampiezza e la polarità dell'impulso stimolante e isola elettricamente l'oggetto biologico dall'apparecchiatura di registrazione.
   2. Per stimolare il nervo, selezionare l'ampiezza sovramassimale dell'impulso stimolante (25%-50% maggiore dell'intensità massima di stimolazione necessaria per attivare tutte le fibre nervose).
      NOTA: Il metodo presentato si basa su uno speciale algoritmo per la registrazione di singoli segnali fluorescenti veloci utilizzando LSCM con sweep minimizzato. Ad ogni passo dell'algoritmo sviluppato, il segnale fluorescente registrato viene spostato dal precedente di un intervallo di tempo più breve dello sweep del microscopio. Il valore degli spostamenti temporali determina la risoluzione temporale del segnale richiesto. Il numero di passaggi (spostamenti) nell'algoritmo dipende dalla risoluzione temporale richiesta e dalla risoluzione temporale originale. Con questo metodo di registrazione, la stimolazione del preparato viene effettuata con una frequenza di 0,25 Hz.
10. Nella modalità Live, cerca il ROI e ottieni la migliore messa a fuoco. Eseguire il software di acquisizione dati.
11. Spostare il ritardo sullo stimolatore di 2 ms in meno rispetto al valore precedente ed eseguire il software di acquisizione dati.
12. Ripetere il passaggio 3.11 26 volte per acquisire 26 sequenze, con ogni sequenza spostata di 2 ms rispetto alla precedente.

Risultati

Figura 1: Lo schema della configurazione sperimentale. 1. Microscopio confocale a scansione laser (LSCM). 2. Modulo di sincronizzazione di LSCM (trigger box). 3. Stimolatore. 4. Unità di isolamento. 5. Il campione biologico. 6. Elettrodo di aspirazione pe...

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