Stimolazione elettrica transcranica della corteccia motoria in un ratto sveglio

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Procedura chirurgica: Impianto di elettrodi toracici

NOTA: Questo passaggio può essere saltato quando il controelettrodo viene posizionato esternamente sul torace rasato con un giubbotto.

1. Posizionare il roditore prono (sul petto) sul tavolo operatorio.
   NOTA: In caso di anestesia per inalazione, tenere il muso del ratto posizionato nell'ugello dell'anestesia, riducendo ulteriormente la concentrazione di isoflurano all'1,5-2%.
2. Disinfettare il cuoio capelluto rasato con uno spray disinfettante o con un tampone imbevuto di un agente antisettico (ad es. etanolo al 70%) e lasciare asciugare all'aria. Ripeti due volte.
3. Tagliare la pelle con un bisturi in una linea dal livello dell'occhio rostrale al livello dell'orecchio medio.
   NOTA: Ciò consente il tunneling del cavo di collegamento dall'elettrodo toracico impiantato verso la parte superiore della testa ed è anche il taglio desiderato per il posizionamento dell'invasatura dell'elettrodo di stimolazione a corrente continua (DCS).
4. Gira il ratto in posizione supina, in modo che il torace sia esposto.
5. Disinfettare la pelle del torace come descritto al punto 1.2.
6. Sollevare la pelle laterale del torace destro con una pinza per fazzoletti e tagliare un'asola con piccole forbici di circa 0,5 cm medialmente dall'ascella destra. Quindi, fai un taglio sagittale dritto in orientamento cranico con le forbici.
7. Formare una sacca sottocutanea disconnettendo atraumaticamente la pelle dal muscolo pettorale principale sinistro. Fallo aprendo ripetutamente le piccole forbici (o con un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione salina).
8. Girare l'animale sul lato destro per scavare il percorso del cavo dall'angolo occipitale sinistro della pelle della testa aperta lungo il collo per uscire nella tasca pettorale penetrando la fascia superficiale utilizzando una pinza omeostatica.
9. Aprire con cautela la pinza omeostatica per afferrare l'estremità del cavo dell'elettrodo attaccato all'elettrodo di platino senza lasciare che i fili taglienti si allontanino. Tirare il cavo attraverso il tunnel fino a quando l'elettrodo non entra nella sacca, orientato con il punto di saldatura verso l'arto posteriore sinistro del roditore. Riportare il roditore in posizione prona.
10. Fissare la placca di platino con una sutura sintetica sterile intrecciata e non assorbibile alla fascia pettorale in corrispondenza dei due fori angolari opposti (si consigliano 4-5 nodi per la stabilità).
11. Allo stesso modo, fissare il cavo alla fascia con un nodo allentato, formando un leggero anello prima dell'ingresso del tunnel tissutale.
12. Chiudere la pelle con 3-4 suture cutanee, a seconda delle dimensioni del taglio (lo stesso materiale di sutura può essere utilizzato per l'elettrodo e il cavo).

2. Procedura chirurgica: Posizionamento della presa di stimolazione cerebrale elettrica transcranica epicranica (tES)

1. Posizionare l'animale in una cornice stereotassica.
   NOTA: Se si utilizza l'anestesia per inalazione, abbassare la concentrazione dell'anestetico a un flusso di isoflurano di mantenimento di ~ 1,5-1%, adattato al riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi e al modello di respirazione.
2. Disinfettare il cuoio capelluto rasato come descritto al punto 1.2.
3. Tagliare la pelle con un bisturi in una linea dal livello dell'occhio rostrale al livello dell'orecchio medio.
   NOTA: Se è stato eseguito il posizionamento dell'elettrodo toracico, i passaggi 2.2 e 2.3 sono già stati eseguiti.
4. Raschiare il periostio (tessuto connettivo del cranio) ai lati con il bisturi e pulire accuratamente con tamponi di cotone. Fissare il tessuto connettivo ai 4 angoli del taglio con pinze bulldog e lasciarli pendere lateralmente per mantenere aperto il campo operatorio.
5. Applicare soluzione fisiologica allo 0,9% per pulire la superficie ossea e il tessuto con tamponi di cotone. Quindi, pulire la superficie ossea con il 3% di H₂O₂. Evitare il contatto con il fazzoletto. In questo modo l'osso viene pulito più a fondo e il sanguinamento minore dall'osso verrà fermato. Inoltre, i residui del periostio diventano visibili. Rimuovere questi residui con un batuffolo di cotone applicando una pressione moderata.
   NOTA: La rimozione dei residui del periostio aumenterà l'adesione e la durata dell'invasatura tES incollata sull'osso.
   1. In caso di sanguinamento inarrestabile, usa un trapano per ossa e toccalo per 1-3 secondi con una leggera pressione sull'osso. Questa procedura meccanica, nella maggior parte dei casi, fermerà l'emorragia senza un riscaldamento significativo. Non usare mai l'elettrocauterizzazione sull'osso; Anche una breve applicazione provocherà danni al tessuto cerebrale (l'elettrocauterizzazione deve essere utilizzata esclusivamente per il sanguinamento del tessuto della ferita).
6. Poiché le viti di fissaggio miglioreranno l'aderenza del set-up, scegliere una punta da trapano adatta alle dimensioni della vite. Posizionare due fori di fresatura su due diverse placche ossee preforando con un trapano a mano e quindi applicando una leggera pressione verticale con il trapano per ossa. Evitare la vicinanza alla posizione desiderata della presa tES, in quanto potrebbe ostacolare l'avvitamento dell'elettrodo (ad esempio, per la tES corticale del motore primario sinistro, scegliere la posizione della vite parietale frontale destra e posteriore).
7. Nel caso di un controelettrodo impiantato, praticare un terzo foro situato nell'osso parietale posteriore destro per la futura fissazione del cavo tunnellizzato.
8. Posizionare le viti di plastica nei fori delle bave e avvitare fino a quando non si avverte il primo attrito. Quindi eseguire altri tre giri di vite di 180°. Controllare con una pinza la stabilità della vite e aggiungere un altro giro se non è abbastanza stretto.
   NOTA: Per i ratti adulti, questo garantirà il posizionamento epidurale delle viti senza danneggiare la dura madre o il cervello (a seconda del design della filettatura della vite, il numero di giro potrebbe variare). Anche l'uso di viti in acciaio inossidabile dovrebbe essere fattibile poiché anche a densità di corrente DCS superiori alla soglia di neurodegenerazione; Il posizionamento delle viti non ha alterato la posizione o l'estensione della lesione al di sotto delle viti.
9. Accendere il saldatore e preriscaldarlo per circa 5 minuti. Avvolgere il cavo che esce dal tunnel tissutale occipitalmente attorno alla vite parietale destra e poi tagliarlo, lasciando circa 1 cm di cavo dietro l'avvolgimento. Spellare accuratamente l'isolamento all'estremità del cavo con un bisturi.
10. Fissare il cavo avvolto alla vite e all'osso con colla cianoacrilica.
11. Applicare una piccola quantità di stagno-saldatura senza piombo al connettore e ai fili scoperti del cavo del controelettrodo e collegare entrambi premendo brevemente entrambe le parti pre-saldate insieme mentre si tocca la punta di saldatura fino a quando lo stagno-saldatura non si scioglie (circa 2-3 s). Rimuovere immediatamente la punta di saldatura per evitare un eccessivo riscaldamento del metallo del cavo con conseguente danneggiamento dei tessuti.
12. Prelevare l'attacco per elettrodi tES su misura (Figura 1B, in rosso) con una pinza a punta piegata e seghettata e applicare un sottile strato di colla cianoacrilica sul bordo inferiore dell'invasatura. Per il posizionamento sopra la corteccia motoria e utilizzando una presa di 4 mm di diametro, posizionare il punto centrale della presa a 2 mm anteriormente e 2 mm lateralmente rispetto alla bregma. Per questa posizione, il bordo mediale interno dell'alveolo dovrebbe terminare direttamente alla sutura sagittale e il bordo caudale dovrebbe terminare all'altezza del bregma. Premere brevemente l'alveolo sull'osso (la maggior parte delle colle cianoacriliche si indurisce con la pressione).
    NOTA: Posizionare una fonte di luce direttamente sopra l'incavo può rendere più facile il posizionamento dell'invasatura.
13. Assicurarsi che l'osso all'interno dell'area dell'alveolo sia privo di colla (controllando con la luce perché la colla è riflettente). In caso di fuoriuscita di colla, rimuovere l'incavo, raschiare la colla con il bisturi e ripetere il passaggio 2.12.
14. Dopo che l'alveolo è in posizione e la futura area di stimolazione è priva di colla, sigillare prima il bordo laterale dell'alveolo al tessuto vicino con una piccola goccia di colla cianoacrilica per evitare un ponte fluido che potrebbe portare a deviazioni di corrente in questa posizione. Non applicare troppa colla in quanto potrebbe fluire nell'area di stimolazione (in tal caso, tornare al passaggio 2.12).
    NOTA: Mantenere l'area di stimolazione libera dalla colla è fondamentale in quanto una riduzione dell'area di stimolazione potrebbe aumentare notevolmente la densità di corrente (A/m²).
15. Coprire tutte le viti con colla cianoacrilica.
16. Mescolare il cemento acrilico dentale bicomponente in un piccolo tubo di silicone o in vetro. Non appena diventa viscoso, applicarlo con una spatola dentale per sigillare i bordi rimanenti dell'alveolo all'osso. Evitare qualsiasi flusso di cemento acrilico dentale nell'area di stimolazione.
17. Infine, coprire l'intero cranio, le viti, il cavo del controelettrodo e l'incavo fino a 1/3 dell'invasatura con cemento acrilico dentale. Assicurarsi che il cemento abbia la viscosità corretta: se è troppo fluido, scorrerà nel tessuto circostante; Se è troppo duro è difficile distribuirlo uniformemente.
18. Quando tutto l'osso è coperto e il cemento è indurito, rimuovi le pinze del bulldog; la pelle dovrebbe toccare appena il cemento accumulato in modo che non sia necessaria la sutura. (Se il taglio iniziale è stato scelto troppo lungo e il tessuto connettivo o il muscolo sono visibili, applicare una sutura come descritto al punto 1.12).
19. Applicare uno strato di iodio con un batuffolo di cotone attorno al bordo della pelle tagliata e iniettare per via sottocutanea il carprofene (5 mg/kg di peso corporeo disciolti in 5-7,5 ml di soluzione fisiologica allo 0,9% per il trattamento del dolore e la sostituzione dei liquidi).
    NOTA: Se si utilizza l'anestesia per inalazione, spegnerla ora.
20. Metti il roditore in una scatola riscaldante per il recupero dall'anestesia fino a quando il roditore non si sveglia e la stabilità posturale viene ripristinata.
    NOTA: Controlla quotidianamente lo sviluppo del peso dell'animale, lo stato della ferita e i criteri di benessere generale secondo le raccomandazioni dell'istituto.

3. Procedura di stimolazione elettrica transcranica

NOTA: Poiché l'anestesia influisce sugli effetti della tES, si consiglia di eseguire la stimolazione nei roditori allertati quando possibile. Lasciare che il roditore si riprenda per almeno 5 giorni (guarigione della testa e della ferita toracica) prima di iniziare gli esperimenti. Gli esperimenti possono essere eseguiti in momenti precedenti dopo l'intervento chirurgico quando si utilizza un controelettrodo esterno fissato con un giubbotto, poiché la ferita toracica è più irritabile, ma gli animali devono essere abituati al giubbotto elettrodo per diversi giorni e potrebbero verificarsi interferenze con le attività comportamentali.

1. Riempire la metà dell'alloggiamento dell'elettrodo tES con soluzione fisiologica allo 0,9% e rimuovere le bolle d'aria.
2. Prima delle sessioni di stimolazione transcranica catodica a corrente continua (tDCS), controllare sempre la clorazione e, se necessario (ad esempio su una superficie argentata lucida), riclorurare l'elettrodo Ag/AgCl. Prima delle sessioni di tDCS anodica, rimuovere eventuali depositi di AgCl in eccesso da precedenti stimolazioni con carta vetrata per consentire una buona conduttività durante la stimolazione. Avvitare il tappo a vite dell'elettrodo tES (Figura 1B, pezzo grigio).
   ATTENZIONE: La mancata riclorurazione dell'elettrodo tra le sessioni di tDCS catodica porterà all'esaurimento della clorazione durante la stimolazione e all'accumulo di sostanze tossiche per reazione elettrochimica. Ciò indurrà danni ai tessuti. La riclorazione non è necessaria all'interno di una singola sessione se la durata della stimolazione è inferiore a 20 minuti.
3. Collegare i cavi ai due connettori sulla testa (per la stimolazione anodica, il cavo anodico è collegato al connettore sul tappo a vite, per la stimolazione catodica è il contrario).
   NOTA: Quando si utilizza un controelettrodo posizionato esternamente, coprire il controelettrodo con gel conduttivo e posizionarlo sul torace del roditore. Questo è più facile se l'elettrodo è prefissato in un piccolo giubbotto per roditori, che il roditore può indossare durante la stimolazione.
4. Posizionare il roditore nella gabbia sperimentale, con i cavi collegati a una girella sopra la gabbia che consente la libertà di movimento.
5. Accendere lo stimolatore e regolare i parametri di stimolazione (intensità della stimolazione, durata, tempo di salita e discesa).
6. Quando non si utilizza un dispositivo di stimolazione disponibile in commercio con un allarme di arresto e disconnessione di sicurezza, includere un misuratore nel circuito per controllare il flusso di corrente costante.
   NOTA: Con questa configurazione, la stimolazione può essere applicata durante l'esecuzione o l'allenamento di compiti comportamentali.
7. Verificare la presenza di segni di stress o disagio nel roditore durante la stimolazione.
8. Al termine della stimolazione, scollegare i cavi, svitare il cappuccio dell'elettrodo sulla testa e pulire e asciugare l'alveolo con un batuffolo di cotone. Riportare il roditore nell'ambiente domestico o procedere con una procedura comportamentale se lo si desidera.

Figura 1: Forniture per la chirurgia e schema tecnico della presa tES e dell'unità di cappuccio dell'elettrodo. (A) 1. Tamponi di cotone, 2. disinfettante, 3. telaio stereotassico, 4. saldatore, 5. analgesico (ad es. carprofene), 6. e 7. anestetici (ad esempio, xilazina e ketamina), 8. siringa, 9. clipper, 10. perforatore per orecchie, 11. unguento per gli occhi (ad es. bepantene), 12. Stagno-saldatura senza piombo, 13. cemento acrilico dentale bicomponente (DAC), 14. iodio, 15. 3% H2O2,16. 0,9% soluzione salina, 17. sutura sintetica intrecciata non assorbibile (ad es. Mersilene 4-0), 18. punte da trapano, 19. colla cianoacrilica, 20. Morsetti Bulldog 21. pinze omeostatiche, 22. pinza a punta piegata e seghettata, 23. pinze a punta dritte e affilate, 24. dritto, pinza per tessuti, 25. spatola dentale, 26. bisturi, 27. forbici, 28. trapano a mano, 29. cacciavite, 30. trapano a motore, 31. connettori femmina, 32. Presa tES, 33. Elettrodo quadrato in platino attaccato al cavo, giunto di saldatura ricoperto di colla istocrilica, 34. viti in plastica. (B) incavo tES (rosso) per il fissaggio sul cranio del roditore con un diametro interno di 4 mm; l'unità elettrodo (grigia) è costituita da un tappo a vite e da un timbro interno con un foro centrale che lascia spazio al cavo dell'elettrodo a disco Ag/Cl, che è incollato sul fondo del timbro. Ciò consente la massima stabilità dell'impostazione ed evita rotture del filo nel punto di connessione filo-elettrodo sensibile.