Abbiamo dimostrato un metodo semplice per l'immissione delle cellule nelle posizioni desiderate su un substrato. Questo metodo di modelli di cellule lanciando un chip di silicone che contiene pozzetti pieni di cellule sul substrato. Questo metodo fornisce un nuovo metodo per modulare la segnalazione diffusibile e juxtacrine tra le cellule.
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Articolo metodologico
Patterning di cellule staminali embrionali che utilizzano il chip Bio flip
In questo articolo
Sommario
Abstract
Interazioni cellula-cellula composta di segnalazione diffondibile e cellula-cellula contatto (juxtacrine segnalazione) sono importanti in numerosi processi biologici come la crescita del tumore, la differenziazione delle cellule staminali e cellule staminali auto-rinnovamento. Un certo numero di metodi esistono attualmente per modulare segnalazione cellulare in vitro. Un metodo di modulare la quantità totale di segnalazione diffusibile è quello di variare la densità di semina delle cellule in coltura. A causa della natura casuale di semina delle cellule, questo si traduce in notevoli differenze nella effettiva cellula-cellula spaziatura e la quantità di contatto cellula-cellula, e non può prescrivere l'ambiente locale. Un approccio più specifico per la segnalazione cellulare modulare è quello di utilizzare gli inibitori molecolari o approcci genetici per abbattere specifiche proteine di segnalazione, ma entrambi questi metodi sono più adatti per la manipolazione di un piccolo numero di molecole. Qui, dimostriamo un nuovo approccio alla modulazione cellula-cellula di segnalazione che modula l'ambiente locale di un cluster di cellule mettendo un diverso numero di celle nelle posizioni desiderate su un substrato. Questo metodo fornisce un modo complementare per controllare la segnalazione locale diffusibile e juxtacrine tra le cellule. Il nostro metodo si avvale della Bio Chip Flip (BFC), un chip di silicone microfabbricazione contenente centinaia a migliaia di pozzetti, ciascuno di dimensioni a detenere un singola cella o un piccolo numero di cellule. Carichiamo il chip con le cellule semplicemente pipettando loro sulla serie di pozzi e di lavaggio delle cellule scaricato fuori l'array. Il chip viene poi girato su un substrato, per cui le cellule caduta dalle fonti e sul substrato, mantenendo la loro patterning. Dopo che le cellule hanno attaccato, il chip può essere rimosso (o sinistra). Questo approccio alla patterning cellulare è unico in quanto: 1) non altera la chimica del substrato, permettendo così alle cellule di proliferare e migrare, 2) permette di patterning su qualsiasi supporto, compreso il tessuto-cultura polistirolo, vetro, Matrigel, e anche alimentatore strati di cellule, e 3) è compatibile con stampa microcontact tradizionali, permettendo la creazione di isole matrice extracellulare con cellule poste all'interno quelle isole. In questo video, dimostriamo il modello delle cellule staminali embrionali di topo sul tessuto-cultura polistirolo utilizzando il BFC.
Protocollo
Fare un BFC
BFCs sono realizzati per stampaggio polidimetilsilossano (PDMS) su un "4 wafer di silicio maestro.
Fare un wafer maestro
- Inizia la disidratazione wafer silicio per 30 minuti a 130 ° C.
- Posizionare la cialda su uno spin-verniciatore, versare SU8-2050 (MicroChem) sul wafer, rampa da 300 giri / s di 3000-4000 giri al minuto, e far girare per 30 s per produrre altezze caratteristica di 40-30 mm, rispettivamente.
- Dopo la filatura, posizionare il wafer su una piastra a 65 ° C, immediatamente rampa fino alla temperatura di 95 ° C per 5-6 minuti, e poi rampa di ....
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Discussione
Anche se il protocollo e il video qui descritto l'utilizzo della BFC 1 a modello le cellule staminali embrionali di topo (mESCs), BFCs può essere usato per modello praticamente qualunque tipo di cellule di interesse. L'unico cambiamento che si possano desiderare di fare è quella di modificare la dimensione dei pozzetti. Nella nostra esperienza, per usare il BFC alle cellule singolo modello di un altro tipo di cellula, un diametro di pozzetti ed altezza pari a 10 micron superiore al diametro delle cellule distaccato funzio.......
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Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere EB007278.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Stampo master in silicio | |||
| Piastre per colture cellulari | Falcon BD | 35-3001 | 35 mm |
| Clip per raccoglitore da 3/4" | |||
| PBS | |||
| esametildisilossano | Shin-Etsu MicroSi | ||
| Nuovo elemento | MicroChem Corp. | SU8-2050 | |
| acetato di PM | |||
| Isopropanolo | |||
| BSA | 7,5% albumina sierica bovina |
Riferimenti
- Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment. Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).
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Ristampe e permessi
