Imaging in vivo delle risposte dei neuroni gangliati genicolati mediante microscopia a epifluorescenza

Abstract

Fonte: Fowler, B. E., et al. Imaging in vivo del calcio delle risposte dei neuroni del ganglio genicolato di topo agli stimoli gustativi. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video mostra un protocollo per la somministrazione di astanti al ganglio genicolato esposto chirurgicamente in un topo anestetizzato e l'utilizzo della fluorescenza GCaMP con microscopia epifluorescente per visualizzare le risposte neuronali in tempo reale, aiutando gli studi sull'elaborazione periferica del segnale del gusto.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Esegui tastant panel
   1. Usa l'aspirazione per rimuovere il liquido sopra il genicolato. Opzionalmente, posizionare un punto assorbente per mitigare le infiltrazioni e facilitare la navigazione al microscopio.
   2. Posizionare l'animale su un tampone assorbente sotto il microscopio. Individua il ganglio genicolato: i punti di riferimento utili includono il foro lasciato nella bolla, il foro nell'osso temporale e il settimo nervo. Utilizzando il filtro FITC/GFP (isotiocianato di fluoresceina/proteina fluorescente verde) sull'endoscopio dell'epifluorescenza, verificare la presenza di singoli neuroni gangliati genicolati che esprimono GCaMP. Un obiettivo 10x (distanza di lavoro di 10 mm) fornirà una risoluzione sufficiente per tracciare l'attività delle singole cellule, ma può essere utilizzato anche un obiettivo 20x (distanza di lavoro di 12 mm).
   3. Posizionare saldamente l'ago di erogazione per la linea tastant nella bocca dell'animale. Metti una capsula di Petri sotto la bocca dell'animale per raccogliere il liquido.
   4. Assicurarsi che la fotocamera stia visualizzando il campo visivo del microscopio. Sincronizza l'inizio della registrazione video con l'inizio della presentazione gustosa.
   5. Durante la registrazione, guarda il feed live per le risposte, la deriva e le infiltrazioni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1ml Siringa con luer lock	Fisher Scientific	14-823-30
Ago per l'erogazione di smussi calibro 27	NC1372532
punti assorbenti	Fisher Scientific	50-930-668
Acesulfame K	Fisher Scientific A149025G
BD Vassoi per allergologi con ago fissato in modo permanente	Fisher Scientific	14-829-6D
Divaricatori smussati	FST	18200-09
Breadboard	Thor Labs	MB8
Supporto per palo testa personalizzato	eMachineShop		Vedi file allegato 202410.ems
Posta con testa in metallo personalizzata	eMachineShop		Vedi file allegato 202406.ems
Regolatore di temperatura CC	FHC	40-90-8D
Fotocamera digitale, sCMOS OrcaFlash4 Microscopio montato	Hamamatsu	C13440
Cannocchiale di dissezione	Leica	M80
LED Sorgente di luce fredda	Leica Mcrosystems KL300LED
Luer Lock 1/16" Adattatori per tubi	Fisher	01-000-116
Microscopio	Olympus	BX51WI
Mini-serie Pali ottici	Thorlabs	MS2R
Piastre di Petri	Fisher Scientific	FB0875713A
Aria pressurizzata	Airgas	AI Z300
Etichettatura autoadesiva Nastro	Fisher Scientific	159015R
Tubo per valvola a manicotto in silicone 1/32" x 1/16" o.d. (per piede)	Automate Scientific	05-14
Snap25-2A-GCaMP6s-D	JAX	25111
Forbici fini per studenti	Strumenti per scienze fini	91460-11
Sonda chirurgica	Roboz Surgical Store	RS-6067
Supporto per sonda chirurgica	Roboz Surgical Store	RS-6061
BD Tubi intramedici	Fisher Scientific	22-046941
Regolatore di gas a due stadi	Airgas	Y12FM244B580-AG
Tygon tubo in vinile - 1/16"	Automate Scientific	05-11
Valvelink8.2 controller digitale/manuale	Automate Scientific	01-18
Valvelink8.2 Sistema di perfusione con valvola a manicotto	Automatizza Scientific	17-pp-54
Xilazina	analizzata NADA	# 139-236

Fisher Scientific