Articolo metodologico

Mouse enucleazione degli occhi per Remote ad alta velocità Fenotipizzazione

DOI:

10.3791/3184

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19 novembre 2011

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1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa, 2Omics Laboratory, University of Iowa, 3School of Dentistry, UCLA, 4Bernard and Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Ophthalmology, College of Physicians and Surgeons, Columbia University

In questo articolo

Sommario

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La tecnica di dissezione illustra enucleazione dell'occhio mouse per il fissaggio del tessuto per eseguire fenotipizzazione in alto throughput schermi.

Abstract

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L'occhio del mouse è un importante modello genetico per lo studio traslazionale di malattia oftalmica umana. Blinding malattie negli esseri umani, come la degenerazione maculare, degenerazione dei fotorecettori, cataratta, glaucoma, retinoblastoma, e la retinopatia diabetica sono stati ricapitolati in topi transgenici. 1-5 topi transgenici e knockout La maggior parte sono stati generati da laboratori per studiare non oftalmiche malattie, ma conservazione genetica tra sistemi di organi suggerisce che molti degli stessi geni possono giocare un ruolo nello sviluppo oculare e malattia. Quindi, questi topi rappresentano una risorsa importante per la scoperta di nuove correlazioni genotipo-fenotipo negli occhi. Poiché questi topi sono sparsi in tutto il mondo, è difficile da acquisire, mantenere e fenotipo in un efficiente e conveniente modo. Così, la maggior parte delle high-throughput schermi fenotipizzazione oftalmiche sono limitate a poche sedi che richiedono in loco, esperienza oftalmico per esaminare gli occhi in topi vivi. 6-9 Un approccio alternativo sviluppato dal nostro laboratorio è un metodo per l'acquisizione remota tessuto che può essere utilizzato nelle indagini grandi o piccole dimensioni di occhi di topi transgenici. Procedure standardizzate per il video a base di trasferimento di competenze chirurgiche, fissaggio del tessuto, e la spedizione di consentire il laboratorio di raccogliere gli occhi interi di animali mutanti e li inviano per fenotipizzazione molecolare e morfologico. In questo articolo video, vi presentiamo le tecniche per enucleare e trasferire sia non fissata e la perfusione del mouse occhi fissi per le analisi fenotipizzazione remoti.

Protocollo

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1. Scollamento: enucleazione dell'occhio mouse in campioni non fissati

  1. Separare le palpebre per migliorare l'esposizione e l'accesso al mondo posteriore (bulbo oculare) di superficie.
  2. Posizionare una pinza curva medicazione dietro (sotto) il globo in orbita (cavità oculare). Il Mahajan Sharptip medicazione pinza è uno strumento personalizzato con punte appuntite per rendere questo passaggio più facile (vedi materiali e reagenti tabella).
  3. Chiudere la pinza e afferrare il tessuto connettivo orbitale e del nervo ottico dietro il globo facendo attenzione a evitare di comprimere il mondo.
  4. Estrarre delicatamente la pinza verso l'alt....

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Discussione

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La maggior parte dei topi transgenici esistono in laboratori che non esaminano gli occhi. La nostra tecnica video illustra un metodo semplice e standardizzato per il trasferimento remoto abilità chirurgica per ottimizzare l'acquisizione tessuti da laboratori con poca esperienza con gli occhi. Questa tecnica video aiuta superare un trabocchetto importante in high throughput fenotipizzazione, che è l'uso di un numero limitato di siti esperti dovuti a non standardizzato di raccolta dei tessuti e fissazione metodi c.......

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Dichiarazioni

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

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La ricerca per prevenire la cecità; Bartly J. Mondino MD, direttore del Jules Stein Eye Institute, UCLA, e Ramiro Ramirez-Solis, Jacqui bianco, e Jeanne Estabel presso l'Istituto Sanger, Wellcome Trust Genome Campus. Questa ricerca è conforme con la dichiarazione ARVO per l'uso di animali in oftalmica e di ricerca visiva.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome Azienda Numero di catalogo Commenti
Curvo Pinza Dressing Storz Ophthalmics E1408
Mahajan Sharptip medicazione pinza Storz Ophthalmics E1406 (REF SP7-64520)
Curve Forbici Westcott Storz Ophthalmics E3321 WH
15 ° BD Beaver microchirurgica Lama Becton-Dickinson 374881
0,22 Fine-Castroviejo sutura Pinze Storz Ophthalmics E1805
0,12 Colibri pinza Storz Ophthalmics 2/132
Ago da 30 gauge Becton-Dickinson 305128
Biohazard Mailer Pescatore 03-523-4
Parafilm Pescatore 13-374-10
Vetro fiale di scintillazione Wheaton 4500413033
PBS, pH 7,4 Invitrogen 70011-044
16% paraformaldeide Scienze della microscopia elettronica 15700
2,5% paraformaldeide / glutaraldeide 2,5% in tampone fosfato di sodio 0,1 M Scienze della microscopia elettronica 15700 & 16300 Misto in laboratorio
50% glutaraldeide Scienze della microscopia elettronica 16300
0,25% formvar Scienze della microscopia elettronica 15810
PoliziottoSlot per Griglia Scienze della microscopia elettronica M2010-CR
Osmio diazoto 4% Scienze della microscopia elettronica 19140
Anti-SOD3 anticorpo Abcam Ab21974
Di capra anti-coniglio Alexa Fluor 488 Invitrogen A11070
Resina incorporamento Spurr Scienze della microscopia elettronica 14300

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
  2. Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold....

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