La tecnica di dissezione illustra enucleazione dell'occhio mouse per il fissaggio del tessuto per eseguire fenotipizzazione in alto throughput schermi.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Mouse enucleazione degli occhi per Remote ad alta velocità Fenotipizzazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'occhio del mouse è un importante modello genetico per lo studio traslazionale di malattia oftalmica umana. Blinding malattie negli esseri umani, come la degenerazione maculare, degenerazione dei fotorecettori, cataratta, glaucoma, retinoblastoma, e la retinopatia diabetica sono stati ricapitolati in topi transgenici. 1-5 topi transgenici e knockout La maggior parte sono stati generati da laboratori per studiare non oftalmiche malattie, ma conservazione genetica tra sistemi di organi suggerisce che molti degli stessi geni possono giocare un ruolo nello sviluppo oculare e malattia. Quindi, questi topi rappresentano una risorsa importante per la scoperta di nuove correlazioni genotipo-fenotipo negli occhi. Poiché questi topi sono sparsi in tutto il mondo, è difficile da acquisire, mantenere e fenotipo in un efficiente e conveniente modo. Così, la maggior parte delle high-throughput schermi fenotipizzazione oftalmiche sono limitate a poche sedi che richiedono in loco, esperienza oftalmico per esaminare gli occhi in topi vivi. 6-9 Un approccio alternativo sviluppato dal nostro laboratorio è un metodo per l'acquisizione remota tessuto che può essere utilizzato nelle indagini grandi o piccole dimensioni di occhi di topi transgenici. Procedure standardizzate per il video a base di trasferimento di competenze chirurgiche, fissaggio del tessuto, e la spedizione di consentire il laboratorio di raccogliere gli occhi interi di animali mutanti e li inviano per fenotipizzazione molecolare e morfologico. In questo articolo video, vi presentiamo le tecniche per enucleare e trasferire sia non fissata e la perfusione del mouse occhi fissi per le analisi fenotipizzazione remoti.
Protocollo
1. Scollamento: enucleazione dell'occhio mouse in campioni non fissati
- Separare le palpebre per migliorare l'esposizione e l'accesso al mondo posteriore (bulbo oculare) di superficie.
- Posizionare una pinza curva medicazione dietro (sotto) il globo in orbita (cavità oculare). Il Mahajan Sharptip medicazione pinza è uno strumento personalizzato con punte appuntite per rendere questo passaggio più facile (vedi materiali e reagenti tabella).
- Chiudere la pinza e afferrare il tessuto connettivo orbitale e del nervo ottico dietro il globo facendo attenzione a evitare di comprimere il mondo.
- Estrarre delicatamente la pinza verso l'alt....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
La maggior parte dei topi transgenici esistono in laboratori che non esaminano gli occhi. La nostra tecnica video illustra un metodo semplice e standardizzato per il trasferimento remoto abilità chirurgica per ottimizzare l'acquisizione tessuti da laboratori con poca esperienza con gli occhi. Questa tecnica video aiuta superare un trabocchetto importante in high throughput fenotipizzazione, che è l'uso di un numero limitato di siti esperti dovuti a non standardizzato di raccolta dei tessuti e fissazione metodi c.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
La ricerca per prevenire la cecità; Bartly J. Mondino MD, direttore del Jules Stein Eye Institute, UCLA, e Ramiro Ramirez-Solis, Jacqui bianco, e Jeanne Estabel presso l'Istituto Sanger, Wellcome Trust Genome Campus. Questa ricerca è conforme con la dichiarazione ARVO per l'uso di animali in oftalmica e di ricerca visiva.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Curvo Pinza Dressing | Storz Ophthalmics | E1408 | |
| Mahajan Sharptip medicazione pinza | Storz Ophthalmics | E1406 (REF SP7-64520) | |
| Curve Forbici Westcott | Storz Ophthalmics | E3321 WH | |
| 15 ° BD Beaver microchirurgica Lama | Becton-Dickinson | 374881 | |
| 0,22 Fine-Castroviejo sutura Pinze | Storz Ophthalmics | E1805 | |
| 0,12 Colibri pinza | Storz Ophthalmics | 2/132 | |
| Ago da 30 gauge | Becton-Dickinson | 305128 | |
| Biohazard Mailer | Pescatore | 03-523-4 | |
| Parafilm | Pescatore | 13-374-10 | |
| Vetro fiale di scintillazione | Wheaton | 4500413033 | |
| PBS, pH 7,4 | Invitrogen | 70011-044 | |
| 16% paraformaldeide | Scienze della microscopia elettronica | 15700 | |
| 2,5% paraformaldeide / glutaraldeide 2,5% in tampone fosfato di sodio 0,1 M | Scienze della microscopia elettronica | 15700 & 16300 | Misto in laboratorio |
| 50% glutaraldeide | Scienze della microscopia elettronica | 16300 | |
| 0,25% formvar | Scienze della microscopia elettronica | 15810 | |
| PoliziottoSlot per Griglia | Scienze della microscopia elettronica | M2010-CR | |
| Osmio diazoto 4% | Scienze della microscopia elettronica | 19140 | |
| Anti-SOD3 anticorpo | Abcam | Ab21974 | |
| Di capra anti-coniglio Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Resina incorporamento Spurr | Scienze della microscopia elettronica | 14300 |
Riferimenti
- Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -S. Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy. Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).
- Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. Cold....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
