Imaging del rilascio di neurotrasmettitori utilizzando reporter ingegnerizzati fluorescenti con neurotrasmettitore basato su cellule

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Impianto di CNiFER nella corteccia di topo

1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave prima dell'intervento chirurgico. Preparare un campo semi-sterile per la chirurgia strofinando con etanolo al 70% e stendendo un pannolino da laboratorio pulito.
2. Preparare la pipetta per iniezione CNiFER tirando un capillare di vetro (diametro interno di 0,53 mm) su un estrattore di elettrodi verticale. Utilizzare un paio di pinze a punta fine n. 5 per rompere la punta dell'elettrodo a un diametro di ~40 μm.
   Nota: questo si ottiene al meglio con uno stereomicroscopio zoom con un reticolo.
3. Anestetizzare un topo adulto (giorno postnatale 60-90) C57BL/6 con isoflurano: 4% (v/v) per induzione e 1,5-2,0% (v/v) per mantenimento. Usa il pizzico della coda o delle dita dei piedi per assicurarti che il topo sia completamente anestetizzato.
   Nota: pizzicare periodicamente e valutare le contrazioni dei baffi durante l'intervento chirurgico per rivalutare la profondità dell'anestesia.
4. Copri gli occhi con un unguento oftalmico per evitare che si secchino. Monta il mouse in una cornice stereotassica con barre auricolari. Mantenere la temperatura corporea del mouse a 37 °C utilizzando un termoforo regolato da una sonda rettale.
5. Radere un'area di circa 5 mm per 12 mm con un rasoio elettrico per animali. Applicare Betadine seguito da isopropanolo al 70% (v/v). Usa la lama di un bisturi per tagliare e rimuovere la pelle sulla superficie del cranio. Usa la lama di un bisturi per rimuovere il periostio dalla superficie del cranio. Esporre e pulire la superficie del cranio, come descritto per la chirurgia stereotassica.
6. Abbassare una pipetta di vetro vuota fino alla bregma e registrare le coordinate antero-posteriore (A/P) e medio-laterale (M/L). Facendo riferimento all'atlante cerebrale del topo, calcolare la posizione del sito di iniezione. Spostare la pipetta nel sito bersaglio e contrassegnare il cranio per la successiva formazione della finestra.
   Nota: Il sito di iniezione e la finestra dipendono dalla regione da studiare e dalla distribuzione dei neurotrasmettitori o delle proiezioni di rilascio di peptidi nella corteccia. Ad esempio, in una recente pubblicazione, le coordinate stereotassiche da +1,0 a +2,0 mm A/P e da +1,0 a +2,0 mm M/L sono state utilizzate per iniettare cellule CNiFER nella corteccia frontale per l'imaging in vivo del rilascio di dopamina durante il condizionamento classico.
7. Formare una finestra del cranio assottigliato di 2 mm x 3 mm.
   Nota: l'osso nella finestra dovrebbe avere uno spessore di 15-20 μm. Le piccole macchie bianche nell'osso non dovrebbero essere visibili quando la superficie del cranio è inumidita, se l'osso è sufficientemente assottigliato.
8. Metti una spugna imbevuta di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) sulla finestra per mantenerla umida mentre prepari le cellule per l'iniezione.
9. Raccogli il clone CNiFER che è stato coltivato in un pallone T75 a ~80% di confluenza. Aspirare il terreno e lavare le cellule con soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS). Nota: la tripsina viene omessa per questi passaggi.
10. Rimuovere la PBS e utilizzare 10 ml di ACSF per rimuovere le cellule dal fondo del pallone. Cellule triturate per dissociare i grumi cellulari. Centrifugare e risospendere il pellet in 100 μl di ACSF. Centrifugare per 30 sec a 1.400 x g e rimuovere il surnatante, lasciando un pellet ricoperto di ACSF. Questo passaggio lascia un grumo di cellule in sospensione.
11. Riempire nuovamente la pipetta di iniezione preparata al punto 1.2 con olio minerale, caricare la pipetta su un nanoiniettore e far avanzare lo stantuffo per espellere una piccola goccia di olio. Mettere 5 μl di sospensione cellulare CNiFER su una striscia di pellicola di paraffina di plastica vicino alla preparazione del topo. Aspirare i CNiFER o le cellule CNiFER di controllo nella pipetta estratta.
12. Spostare la pipetta sulle coordinate X e Y target, ovvero A/P e M/L indicate al punto 1.5. Abbassare la pipetta, perforando il cranio assottigliato, e continuare a ~200-400 μm sotto la superficie del cranio, per depositare le cellule CNiFER negli strati 2/3 della corteccia.
13. Iniettare ~4,6 nl di cellule CNiFER nel sito più profondo con il nanoiniettore, notare il movimento nell'interfaccia tra olio e cella e quindi attendere 5 minuti affinché le celle vengano erogate. Estrarre la pipetta da ~100 μm e iniettare altri ~4,6 nl di cellule CNiFER, attendere 5 minuti. Quindi estrarre la pipetta lentamente e delicatamente per evitare il riflusso dei CNiFER. Ripetere le iniezioni in uno o più siti adiacenti.
14. Ripetere i passaggi di iniezione 1.8-1.12 con cellule HEK293 di controllo (ad esempio, clone HEK293/TN-XXL/Gqi5 privo di recettore accoppiato a proteina G [GPCR]). Separare il CNiFER e i siti di iniezione della cella di controllo di ~200 μm.
15. Dopo aver completato gli impianti cellulari, sciacquare la finestra del cranio assottigliato con ACSF e attendere che il cranio si asciughi. Applicare una goccia di colla cianoacrilica (vedi Materiali) sulla finestra e posizionare rapidamente un vetro di copertura sterile pretagliato sopra la colla. Spingere delicatamente il vetro di copertura contro il teschio per alcuni secondi. Lasciare asciugare la colla per 2 minuti.
16. Sigillare i bordi del vetro di copertura con cemento dentale e formare un pozzetto intorno alla finestra per trattenere l'acqua per l'obiettivo di immersione.
17. Per immobilizzare la testa del mouse durante l'imaging, fissare una barra per la testa personalizzata con una piccola goccia di colla cianoacrilica dietro la finestra. Lascia asciugare completamente la colla e poi aggiungi altro cemento dentale per rinforzare ulteriormente la barra di testa costruita su misura.
18. Copri il resto della superficie del cranio, ad eccezione della finestra, con uno strato di cemento dentale. Assicurati che i bordi della pelle siano coperti da cemento e lascia asciugare per 20 minuti.
19. Dopo l'intervento chirurgico, interrompere la somministrazione di isoflurano e lasciare il mouse su un termoforo in una gabbia fino a quando non si riprende completamente dall'anestesia. Iniettare il 5% (p/v) di glucosio in soluzione fisiologica (sottocutanea [s.c.]) per la reidratazione e da 0,05 a 0,1 mg/kg di buprenorfina (intraperitoneale [i.p.], rilascio istantaneo) per l'analgesia post-operatoria.
    Nota: per ridurre al minimo la potenziale reazione immunologica ai CNiFER umani, iniettare quotidianamente nel topo 20 μl/100 g di ciclosporina (i.p.) a partire dal giorno prima dell'iniezione di CNiFER.
20. Rimetti il topo nella sua gabbia di casa per cibo e acqua.

2. Imaging in vivo di cloni CNiFER

Nota: l'imaging dal vivo viene condotto con i topi utilizzando un microscopio a due fotoni e un apparecchio fissato alla testa. Non è necessaria alcuna anestesia durante le sessioni di imaging. Quando si fotografano animali in stato di veglia, limitare il poggiatesta a poche ore alla volta per ridurre i livelli di stress. Riporta l'animale nella gabbia di casa tra le sessioni di imaging per cibo e acqua. Il potenziale stress è ridotto al minimo oscurando le luci della stanza e la parte circostante del mouse in un involucro.

1. Il giorno dopo l'intervento, montare il mouse su una piattaforma di imaging avvitando la barra della testa in metallo impiantata sul cranio al telaio di fissaggio della testa.
   Nota: quando si esegue l'imaging di topi svegli, la sessione di imaging non deve superare alcune ore a causa del potenziale stress indotto dal dispositivo di ritenuta della testa.
2. Posizionare la piattaforma di imaging con il mouse trattenuto in un microscopio per immagini a due fotoni dotato di obiettivi a immersione in acqua 10X (0,30 NA) e 40X (0,80 NA).
3. Inserire il cubo filtrante per l'imaging a trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET) (Enhanced Cyan Fluorescent Protein [eCFP] and Citrine) dotato di uno specchio dicroico a 505 nm e di filtri passa-banda che si estendono da 460 nm a 500 nm per la misurazione di eCFP e da 520 nm a 560 nm per la misurazione del citrino.
4. Aggiungere l'ACSF al pozzetto contenente la finestra del cranio assottigliato e abbassare l'obiettivo di immersione in acqua nell'ACSF. Utilizzare l'oculare in combinazione con una lampada al mercurio e un cubo filtrante per proteine fluorescenti verdi (GFP) per individuare la superficie della corteccia e del sistema vascolare sotto la finestra.
   Nota: il modello del sistema vascolare aiuta a localizzare e visualizzare la stessa regione per giorni ripetuti di imaging. Passa all'obiettivo a immersione in acqua 40X per localizzare i CNiFER concentrandoti manualmente sulla superficie della corteccia sopra le celle utilizzando il cubo filtrante GFP e una lampada al mercurio.
5. Predisposizione per l'imaging a due fotoni. Selezionare il percorso della luce appropriato per l'imaging a due fotoni. Per un tipico sistema commerciale, utilizzare il software per passare alla modalità di imaging a due fotoni e reindirizzare la luce ai tubi fotomoltiplicatori (PMT) nei rivelatori non descanned. Accendere il laser pulsato a femtosecondi nel vicino infrarosso, selezionare una lunghezza d'onda di 820 nm e un'impostazione di potenza del 5-15%.
   Nota: la potenza del 5% fornisce in genere ~25 mW al campione.
6. Impostare la tensione PMT1 e PMT2 vicino al valore massimo, tipicamente 700-1.000 V a seconda del PMT. Impostare il guadagno su 1 per ogni canale e azzerare la posizione z per l'obiettivo.
7. Abbassare l'obiettivo da ~100 a 200 μm dalla superficie corticale e avviare la scansione x-y. Regolare la potenza del laser, il guadagno e la tensione PMT per ciascun canale, ad esempio eCFP e citrino, per ottimizzare il rapporto segnale/rumore della fluorescenza CNiFER.
8. Utilizzare la funzione di zoom del software per limitare l'immagine a una regione che contiene le celle CNiFER e a una regione di sfondo. Utilizzare una velocità di scansione non inferiore a un fotogramma ogni 2 secondi (0,5 Hz) a 4 μs per pixel. Regolare la media delle linee per ottenere un rapporto segnale/rumore adeguato, ad esempio la media a 2 linee di Kalman.
9. Disegna una regione di interesse (ROI) attorno alle celle CNiFER, circondando circa 3 o 4 celle per piano. Imposta l'analisi in tempo reale delle intensità medie del ROI. Avviare l'acquisizione per monitorare la fluorescenza di CNiFER nel tempo.
10. Raccogliere la fluorescenza dai CNiFER prima e durante le manipolazioni sperimentali, ad es. stimolazione elettrica, stimolazione della canalrodopsina-2 (ChR2), comportamento, come determinato dall'utente.
11. Al termine dell'esperimento di imaging, riportare il topo nella sua gabbia di casa. Ripetere l'imaging per più giorni, come desiderato. Quando si esegue nuovamente l'imaging delle cellule, fare riferimento all'immagine vascolare a basso ingrandimento precedentemente acquisita per orientarsi nuovamente allo stesso campo di imaging (passaggio 2.4).
    Nota: i CNiFER impiantati possono essere sottoposti a imaging per almeno 7 giorni.