Sistema di microiniezione a base microfluidica per l'infusione combinata di farmaci ed elettrofisiologia

Abstract

Fonte: Vanegas, M. I., et al. Sistema di microiniezione per l'infusione combinata di farmaci ed elettrofisiologia. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra un dispositivo microfluidico basato su microelettrodi che eroga una soluzione farmacologica attraverso un tubo capillare, utilizzando una soluzione marcatore a base di olio per un monitoraggio preciso del volume e consentendo la registrazione neurale simultanea e l'infusione di farmaci.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Costruzione del microiniettotubo per la stimolazione e la registrazione (Figura 1a)

1. Misurare la lunghezza della cannula e della sonda (in questo esempio, un nanosensore). La sonda deve essere più lunga della cannula per la lunghezza che deve sporgere dalla punta della cannula (a seconda del design della sonda), più circa 2 cm.
2. Sotto una lente d'ingrandimento o un microscopio (ingrandimento ~10x), caricare la sonda nella cannula; se possibile è preferibile un caricamento all'indietro per proteggere la punta della sonda.
   NOTA: Questo passaggio, eseguito manualmente, è impegnativo. Si consiglia di esercitarsi con un microelettrodo sotto una lente d'ingrandimento prima di tentare con una vera sonda sperimentale.
3. Far passare la cannula (contenente la sonda) attraverso la ghiera superiore, la giunzione a T e la ghiera inferiore.
   1. Se la sonda è solo un singolo filo senza alcun attacco, caricalo nella cannula e inserisci il gruppo nella giunzione a T dalla ghiera inferiore. La parte superiore della cannula (lato piatto) deve essere posizionata al centro della giunzione a T, all'interno della ghiera inferiore ma non di quella superiore. La sonda sperimentale o il biosensore devono sporgere sopra la parte superiore della ghiera.
      NOTA: Le boccole su misura possono essere realizzate anche praticando un foro nei tappi della ghiera utilizzando micro punte da trapano, la dimensione del foro si basa sul diametro necessario per serrare la cannula alla giunzione a T.
4. Utilizzare la chiave per boccole per serrare le boccole sulla parte superiore e inferiore della giunzione a T. Non stringere eccessivamente. È possibile aggiungere un piccolo pezzo di tubo per rafforzare il supporto dell'elettrodo all'interno della ghiera superiore.
5. Saldare i pin d'oro a ciascuno dei terminali della sonda (segnale, massa, ecc.), in base alle specifiche della sonda.
6. Regolare la posizione relativa della sonda e della cannula. Misurare la distanza in cui la sonda sporge dalla cannula sotto ingrandimento e regolare manualmente dall'estremità superiore (la sonda può scorrere liberamente all'interno delle ghiere).
7. Aggiungere la colla epossidica tra i perni d'oro e la ghiera superiore per fissare la sonda alla ghiera.
8. Svitare la ghiera superiore per ritrarre la sonda all'interno della cannula. Verificare visivamente che la sonda sia completamente all'interno della cannula sotto ingrandimento.
9. Collegare l'iniettore al microdrive.

2. Costruzione del microiniettodo per l'infusione di farmaci (Figura 1b)

1. Fissare l'estremità "non smussata" o piatta della cannula alla parte inferiore del giunto a T utilizzando una ghiera. Utilizzare la chiave per ghiere per serrare la ghiera.
2. Collegare un piccolo pezzo di tubo capillare (~1,5 cm) alla parte superiore del giunto a T facendolo passare attraverso la ghiera standard. Serrare con una chiave a ghiera.
3. Caricare il microelettrodo attraverso il tubo capillare, il giunto a T, la cannula e le ghiere corrispondenti.
4. Assicurarsi che l'estremità posteriore dell'elettrodo sporga di meno di 1 cm dalla parte posteriore del tubo capillare e che la punta dell'elettrodo sporga dalla cannula alla distanza desiderata sul lato inferiore. La posizione dell'elettrodo può essere regolata manualmente dall'estremità superiore.
5. Saldare un pin d'oro al terminale del microelettrodo.
6. Aggiungere la colla epossidica tra il perno d'oro e la ghiera superiore per fissare il microelettrodo alla ghiera.
7. Svitare la ghiera superiore per ritrarre la sonda all'interno della cannula. Confermare visivamente che il microelettrodo sia completamente retratto nella cannula.

3. Costruzione del circuito microfluidico (Figura 2)

1. Posizionare una breadboard su una superficie stabile. Posizionare le due valvole a tre vie parallelamente ai lati più lunghi della breadboard, circa 6 pollici. distanziate, con una porta (quella sempre aperta) di fronte all'altra. Utilizzare le viti per fissare le valvole alla breadboard.
2. Posizionare un righello accanto alle valvole (per misurare e tracciare il movimento dei fluidi all'interno del tubo capillare).
3. Caricare una miscela di olio a bassa viscosità 1:1 e colorante alimentare (pennarello) nella siringa a tenuta di gas e inserirla nella pompa Marker. Tagliare un pezzo di tubo capillare e utilizzare ghiere standard e connettori Luer-lock per collegare la siringa a una delle porte sulla valvola di ingresso. Questa è la "linea di marcatura".
4. Tagliare un breve pezzo di tubo capillare per la "linea righello". Utilizzare ghiere standard per serrare le porte rivolte verso l'esterno delle valvole.
5. Tagliare due pezzi più lunghi di tubo capillare per collegare la valvola di uscita al microiniettore e per collegare la pompa del farmaco alla valvola di ingresso (utilizzare ghiere standard).
   NOTA: La lunghezza di queste due linee dipende dalla configurazione sperimentale, una deve essere abbastanza lunga da raggiungere dall'apparato di infusione all'animale e l'altra dalla pompa del farmaco alla valvola di ingresso. Utilizzare una pietra da taglio per tagliare il tubo capillare.

4. Montaggio del microiniettore sul microdrive (Figura 3)

1. Assicurarsi che il microelettrodo/sonda sperimentale sia retratto nella cannula prima del montaggio.
   NOTA: Il tubo guida deve essere in una posizione nel microdrive.
2. Collegare un adattatore su misura al microiniettore.
3. Caricare dall'alto il microiniettotubo attraverso il tubo guida e fissarlo all'adattatore utilizzando le viti.
4. Misurare la posizione del microazionamento (profondità) alla quale il microiniettore sporge dal tubo guida, quindi ritrarlo di ~1 cm per prepararsi all'inserimento.
5. Per gli esperimenti di microinfusione, collegare la "linea cerebrale" all'apertura della giunzione a T inutilizzata del microelettrodo. Utilizzare una ghiera standard e serrarla con una chiave per ghiere.

5. Lavaggio e preparazione del sistema microfluidico

1. Posizionare il microdrive con il microiniettografo su un becher di scarto.
2. Caricare la clorexidina (ad es. nolvasan, disciolta a 20 g/L) nella siringa a tenuta di gas da 1 ml e inserirla nella pompa del farmaco. Ruotare la direzione del flusso delle valvole in modo tale che il fluido vada dalla pompa del farmaco attraverso la valvola alla linea della valvola e fuori dalla "linea del cervello".
3. Lavare il circuito con clorexidina utilizzando una bassa portata (50-200 μL/min) per un minimo di 10 minuti. Ripetere i passaggi da 5.2 a 5.3 con soluzione fisiologica sterile e poi aria.
   NOTA: È importante verificare la presenza di perdite in questa fase. Applicare delicatamente salviette prive di lanugine sulle giunzioni per aiutare a rivelare eventuali perdite di liquido attraverso le ghiere.
4. Caricare il farmaco nella siringa a tenuta di gas da 500 μl, comprimere l'aria e quindi inserirlo nella pompa del farmaco. Flusso a 50 μL/min fino a quando alcune gocce fuoriescono dal microiniettore.
5. Immergere il tubo guida nella clorexidina (sciolta a 20 g/L) per 15 minuti.
6. Ruotare la direzione della valvola di uscita verso la "linea di lavaggio". Far avanzare la pompa del pennarello fino a quando non si osserva un bordo chiaro di colore e olio sulla linea del righello. Assicurati che ci sia sempre olio tra il farmaco e il colore per non mescolare i due materiali idrosolubili e perdere il bordo tagliente tra di loro. Segna la posizione iniziale di questa linea di olio/colorante (con un pezzo di nastro adesivo o pennarello).
7. Ruotare la direzione della valvola di uscita verso la linea del cervello.

6. Esecuzione della registrazione o di un esperimento di infusione

NOTA: Le fasi di manipolazione degli animali variano a seconda del laboratorio e dell'esperimento. I seguenti passaggi devono essere eseguiti dopo il necessario set-up chirurgico e la preparazione per esporre la dura. Dopo l'esperimento, tutte le fasi post-procedura necessarie devono essere eseguite in conformità con i protocolli approvati istituzionalmente.

1. Collegare il microdrive alla camera di registrazione. Abbassare il tubo guida per penetrare nella dura.
   NOTA: Il tubo guida non deve penetrare oltre la dura madre per evitare di danneggiare la corteccia.
2. Abbassare il microinietto, a circa 2 mm sopra il sito di registrazione/iniezione nel cervello.
3. Serrare la ghiera superiore (microelettrodo/biosensore sporgente) e collegare i pin dorati al sistema di registrazione. Continuare a far avanzare il microiniettore verso il sito di destinazione.
   NOTA: Ricordarsi di includere nei calcoli la distanza che il microelettrodo si estende oltre la cannula.
4. Per gli esperimenti di infusione, utilizzare la micropompa manuale a microsiringa per spostare la colonna di olio di 1 cm ogni 3 minuti (~60 nL/min). Una volta che il volume desiderato è stato infuso, spostare la valvola di uscita verso la linea di lavaggio.
   NOTA: Il volume infuso varierà in base alla specie del modello e all'area cerebrale mirata. Velocità di flusso più elevate possono danneggiare il tessuto neurale.
5. Al termine degli esperimenti, ritrarre il microiniettore all'interno del tubo guida (lasciare la sonda sporgente). Quindi rimuovere il microdrive per il lavaggio. Lavare il sistema microfluidico per prepararlo al riutilizzo. nota: Nella nostra esperienza, il microiniettoidato durerà per diversi usi se si presta la dovuta attenzione. La qualità della registrazione elettrofisiologica diminuisce più velocemente della capacità di iniezione.

Risultati

Figura 1: Fabbricazione passo dopo passo del microiniettore. (a) Configurazione per l'uso indipendente dal sistema microfluidico. La cannula e la sonda vengono misurate per confermare che la punta della sonda possa essere ...

Materiali

https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24 Spina monopezzo LabSmith (C360-101)https://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24 Chiave a ghiera LabSmith 1/8" chiave esagonale per l'installazione di raccordi e spine monopezzo (LS-HEX 1/8" Hex Wrench) https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
valvole manuali a 3 porte	Valvola selettrice manuale a 3 porte LabSmith (MV201-C360)	https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26
Cannule	Vita Needle Company	304 Tubo in acciaio inossidabile, diametro esterno 228μm, diametro interno 165μm	https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf
Pietra di taglio	Molex	Pietra di taglio 1" x 1" (parte n. 1068680064)	Si consiglia vivamente di seguire il metodo per la scissione dei tubi capillari: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf
Clorexidina diacetato	Walmart	Nolvasan soluzione disinfettante (AAP311)	Utilizzato per il lavaggio del circuito microfluidico, disciolto a 20 g/L
Adattatore personalizzato	Fornitore	personalizzato-Adattatore	lavorato su misura per collegare la microiniezione al microazionamento idraulico
Driver	Cacciavite TORX LabSmith	T7 per l'installazione di viti breadboard (driver LS-TORX)	https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25
Colla epossidica	LabSmith	Adesivo epossidico bicomponente ad alta resistenza (LS-EPOXY) per l'incollaggio di metallo e plastica	https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24
Ferula	Raccordo monopezzo LabSmith	(C360-100) per il collegamento di capillari, foro passante dimensionato per capillare con diametro esterno di 360 μm
		per l'uso in qualsiasi porta -C360
			Siringa
a tenuta di gas	Hamilton Company	Siringa a tenuta di gas da 500 μL modello 1750 (81220) e siringa a tenuta di gas da 1 ml modello 1001 (81320)	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top Perni in oro Aim-Cambridge Maschio placcato in oro
		pin del connettore a crimpare (40-9856M)	https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html
salviette prive di lanugine	Kimberly Clark	Kimtech Science Kimwipes Delicate Task	Salviette prive di lanugine, utilizzate per identificare le perdite nel sistema
Colorante	alimentare liquidoMcCormick & Co.	Colorante alimentare liquido nero a base d'acqua (52100581873)	https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color
Olio a bassa viscosità	Clearco Products Co.	Fluido siliconico puro ottametiltrisilossano con viscosità di 1cSt a 25°C (PSF-1cSt)	http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html
Connettore Luer-Lock	LabSmith	Luer-Lock Adapter (C360-300), raccordo femmina per il collegamento della siringa Luer Lock a un tubo capillare	da 360μmhttps://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24
Micro punte	Grainger	Micro punta da trapano, 0,23 mm (414H85)	https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits
Microelettrodo	FHC	Microelettrodo metallico, tungsteno con isolamento	epossidicohttps://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes
Micromanipolatore oleodinamico	Narishige Group	Micromanipolatore oleodinamico con tubo guida collegato (MO-96)	http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html
Tubo capillare Polymicro Tubo capillare	flessibile in	silice fusa Molex Polymicro (TSP150375), diametro esterno 375μm, diametro interno 150μm	https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf a
siringa programmabile	Harvard Apparatus	Standard Infuse/Withdraw Pump, programmabile (70-2213)
Ruler	Empire	Acciaio inossidabile 6" Righello rigido (27303)	http://www.empirelevel.com/rulers.php Set di
viti	LabSmith	Set di viti per il montaggio della valvola (LS-SCREW .25), viti autoformanti (2-28 x 1/4") per montare le valvole sulla breadboard	https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24
Piattaforma Breadboard standard	LabSmith	da 4" x 6" (LS600), con spaziatura dei fori di 0,25" per il montaggio del circuito del fluido	https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24
Soluzione salina sterile (cloruro di sodio) 0,9%.	infusione endovenosa sterile	Baxter	0,9% cloruro di sodio
	Millipore Sigma	MilliporeFiltri per siringhe sterili Sigma™ Millex-GP™ con membrana PES (SLGPM33RS)
Pompa manuale per microsiringhe Stoelting	Company Pompa	manuale per infusione/prelievo (51222)	https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html
Giunzione a T	LabSmith	T di interconnessione (C360-203) per la combinazione di flussi di flusso, per l'uso con tubi capillari con diametro esterno di 360 μm<

https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.htmlFiltri per siringhe sterili per https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rsa href='https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24'>https://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24