Somministrazione mirata di sostanze al cervello del topo tramite infusione nell'arteria carotide interna

Abstract

Fonte: Leda, A. R., et al. Tecnica di infusione di microchirurgia del topo per la somministrazione mirata di sostanze nel SNC attraverso l'arteria carotide interna. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra una procedura microchirurgica progettata per facilitare l'infusione mirata di una sostanza in esame nel cervello attraverso l'arteria carotide interna (ICA). La procedura prevede una sutura precisa e una manipolazione vascolare per limitare temporaneamente il flusso sanguigno, garantendo una somministrazione controllata. Un tubo capillare viene inserito nell'arteria carotide esterna (ECA) e fatto avanzare verso la biforcazione. Dopo l'infusione, la sostanza bypassa la circolazione sistemica, attraversa la barriera emato-encefalica e raggiunge la consegna mirata al parenchima cerebrale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione dei topi per la chirurgia

1. Anestetizzare il topo con isoflurano miscelato con ossigeno, utilizzando un sistema di anestesia da laboratorio. Utilizzare l'isoflurano a una temperatura compresa tra il 4-5% e un flusso di ossigeno a 2 L/min sulla macchina commerciale (vedere la tabella dei materiali). Trasferire l'animale sulla superficie chirurgica, sotto uno stereomicroscopio, e sostenere l'anestesia utilizzando un cono nasale (utilizzare l'impostazione dell'isoflurano 1,5 - 2,5 e il flusso di ossigeno a 2 L/min).
   1. Assicurati che la frequenza respiratoria del mouse sia di circa 1 - 2 respirazione/sec senza ansimare. Inoltre, assicurarsi che l'animale non mostri una reazione di stimolazione dei baffi e un riflesso del pedale (pizzicamento delle dita). Monitorare la frequenza respiratoria e lo sforzo durante l'intervento, almeno ogni 5 minuti. Seguire le linee guida specifiche del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e veterinarie per il monitoraggio dell'anestesia dei roditori.
2. Applicare una goccia di lubrificante oftalmico su ciascun occhio utilizzando un tampone sterile per prevenire la secchezza. Si consiglia la somministrazione di antinfiammatori e analgesici per alleviare il disagio.
3. Con l'animale sdraiato sulla schiena, mantenere l'anestesia usando un cono nasale.
4. Pulisci la zona del collo dell'animale strofinando l'area tre volte con etanolo al 70% e clorexidina. Radere l'area chirurgica dell'animale usando un rasoio (descritto di seguito).

2. Dissezione dell'arteria carotide comune (CCA)

1. Eseguire l'intera procedura di microchirurgia al microscopio. Utilizzando forbici chirurgiche e pinze, eseguire un'incisione superficiale della linea mediana nel collo, da sopra lo sterno a sotto la mascella (circa 3-4 cm).
2. Usando una pinza, separare accuratamente il tessuto adiposo e connettivo per esporre la trachea.
3. Posiziona un cuscino (oggetto rotondo, di circa 0,5 cm di diametro) sulla parte posteriore del collo del topo per estendere il collo, esponendo ulteriormente l'area.
4. Separare il tessuto utilizzando un divaricatore o uncini.
5. Sul lato sinistro della trachea dell'animale, separare con cura il tessuto connettivo per esporre il CCA sinistro.
6. Usando una pinza, rimuovere con cura tutto il tessuto connettivo per esporre la biforcazione CCA e l'inizio delle arterie carotidi esterne e interne.

3. Preparazione del CCA per l'infusione della sostanza

1. Inserire due segmenti di sutura di nylon (circa 1 cm ciascuno) sotto l'arteria carotide esterna (ECA), utilizzando una pinza.
2. Posizionare un nodo permanente nel punto più alto possibile dell'ECA.
3. Nel punto più basso possibile dell'ECA, immediatamente sopra la biforcazione CCA, posizionare un nodo rimovibile. Questo nodo dovrebbe essere allentato rispetto al nodo superiore.
4. Chiudere il CCA utilizzando una clip per serbatoio, nel punto più basso possibile.
5. Chiudere l'arteria carotide interna (ICA) utilizzando una clip per vasi.
6. Utilizzando le forbici a molla per microdissezione eseguire un piccolo taglio nell'ECA (circa 2 mm), tra i due nodi.

4. Infusione di sostanze tramite ICA

1. Assemblare un sistema di infusione. Collegare 6 pollici di tubo capillare (dimensioni ideali: 2,5 mm x 1,2 mm) a una siringa di tubercolina contenente 250 μl della sostanza da infusare (farmaci, agenti patogeni, vescicole extracellulari, tra gli altri) e inserire delicatamente la punta capillare nell'incisione eseguita al passaggio 3.6.
2. Continuare a scorrere lungo il capillare fino a raggiungere un punto medio tra la biforcazione e la clip che chiude il CCA.
3. Annodare il nodo ECA inferiore. Verificare che il nodo sia sufficientemente largo da consentire la fluidità dei capillari e sufficientemente stretto da evitare perdite.
4. Rimuovere la clip dall'ICA.
5. Applicare delicatamente una pressione sul pistone della siringa consentendo l'infusione della sostanza a circa 10 μl al secondo.

5. Procedure post-infusione

1. Riposizionare la clip sull'ICA.
2. Rimuovere delicatamente il tubo capillare.
3. Legare completamente il nodo ECA inferiore.
4. Rimuovere le clip dall'ICA e dal CCA.

6. Chiusura dell'incisione e cura post-operatoria

1. Rimuovere il divaricatore o i ganci per tessuti e il cuscino.
2. Pulire l'area della sutura con soluzione fisiologica sterile.
3. Chiudere l'incisione utilizzando una sutura/ago di nylon e una pinza.
4. Somministrare antinfiammatori e analgesici per alleviare il disagio post-operatorio.
5. Posizionare l'animale in una gabbia posta sul termoforo per almeno 1 ora e monitorare il recupero.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Strumento per anestesia	Vetequip	901806
Forbici chirurgiche	Fine Science Tool	14558-09
Pinze chirurgiche punta dritta	Fine Science Tool	00108-11
Pinza chirurgica punta angolata	Fine Science Tool	00109-11
Forbici a molla	Fine Science Tool	15000-08
Sutura in nylon	Braintree Scientific	SUT-S 104
Tubo capillare (Micro-Renathane 0,010" x 0,005" per ft.)	Braintree Scientific MRE01050
Sutura di chiusura	VWR	95057-036
Isoflurano	Piramal
2,3,5-Trifeniltetrazolio cloruro	FisherScientific	50-121-8005