Imaging della dinamica subcellulare del calcio nei neuroni di Caenorhabditis elegans

Abstract

Fonte: Doser, R., et al. Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo. J. Vis. Exp. (2023)

Questo video mostra l'imaging in vivo del flusso di calcio subcellulare nei neuroni del cordone nervoso ventrale dei ceppi transgenici di Caenorhabditis elegans. Vengono impiegati due indicatori di calcio distinti: un indicatore citoplasmatico in un ceppo e un indicatore mitocondriale in un altro. I neuroni vengono osservati al microscopio a fluorescenza per monitorare in tempo reale i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza all'interno del citoplasma neuronale e dei mitocondri, riflettendo il flusso di calcio durante l'attività neuronale spontanea.

Protocollo

1. Preparazione dei vermi per l'imaging

Preparazione dei tamponi di agar
1. Make 3mL di agar al 10% sciogliendo l'agar di grado molecolare in M9 in una provetta di coltura di vetro da 13 mm x 100 mm e microonde per diversi secondi.
  NOTA. L'agar fuso può essere conservato su un blocco termico per un massimo di 1 ora o può essere preparato fresco ogni volta che sono necessari i tamponi di agar.
2. Posizionare un vetrino da microscopio tra due vetrini aggiuntivi con due strati di nastro da laboratorio (vedere Figura 1A-i).
3. Tagliare il puntale di un puntale per pipetta da 1.000 μl (senza filtro) e utilizzarlo per pipettare una piccola goccia di agar sul vetrino coprioggetti centrale (Figura 1A-i).
4. Appiattire l'agar premendo un altro cursore verso il basso sulla parte superiore dell'agar (Figura 1A-ii).
5. Dopo il raffreddamento, tagliare l'agar in un piccolo disco utilizzando l'apertura di una provetta di coltura in vetro da 13 mm x 100 mm (Figura 1A-iii), quindi rimuovere l'agar circostante.
Preparando la soluzione per il rotolamento dei vermi
1. Sciogliere la polvere di muscimolo in M9 per creare un brodo da 30 mM. Separare in aliquote da 50 μl e conservare a 4 °C.
2. Scongelare una nuova aliquota di 30 mM di mM di muscimolo ogni 3-5 giorni (e conservare a 20 °C durante l'uso).
3. Diluire un 30 mM di moscimolo in rapporto 1:1 con perle di polistirene per ottenere la soluzione di rotolamento.
Posizionamento di un verme per l'imaging
1. Posizionare 1,6 μL della soluzione di rotolamento al centro del pad di agar.
  NOTA: La quantità di liquido deve essere regolata per l'imaging di animali più giovani (meno) o più anziani (più).
2. Utilizzando il plettro a vite senza fine preferito (cioè un plettro a filo di vetro o platino), trasferire un verme dell'età desiderata senza il fenotipo multi-vulva nella soluzione di rotolamento sul tampone di agar (Figura 1A-iv). nota. I dati rappresentativi provengono da ermafroditi di 1 giorno (ceppo GCaMP6f = FJH185; ceppo mitoGCaMP; FJH597), che può essere identificato dalla presenza di una sola fila di uova.
3. Attendere ~5 minuti affinché il muscimolo riduca il movimento del verme, quindi far cadere un vetrino coprioggetti di 22 mm x 22 mm sopra il tampone di agar, limitando fisicamente il movimento del verme.
4. Per l'imaging dei neuriti nel midollo nervoso ventrale, arrotolare il verme nell'orientamento mostrato nelle Figure 1B e 1C facendo scorrere leggermente il vetrino coprioggetti.
  NOTA. Per visualizzare il cordone nervoso ventrale, posizionare il verme con la testa verso l'alto e far rotolare il verme fino a quando l'intestino non si trova sul lato destro della porzione prossimale e a sinistra per la parte distale del verme (dal punto di vista dell'osservatore). Invertire questo orientamento (Figura 1C) per l'imaging dei neuriti nel cordone nervoso dorsale.
Montare il verme su un microscopio
1. Metti una goccia di olio da immersione sul vetrino coprioggetti prima di montarlo sul tavolino del microscopio.
2. Trova il verme utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento (10x) in campo chiaro.
3. Passa all'obiettivo 100x e regola la messa a fuoco.
4. Localizzare il neurite AVA utilizzando l'illuminazione del GCaMP o del mitoGCaMP con il laser di imaging a 488 nm.
  NOTA: Utilizzare piccole regolazioni per evitare di schiacciare il verme o di staccare il vetrino coprioggetti.

2. Acquisizione di flussi di immagini ad alta risoluzione

Imaging GCaMP in vivo
1. Imposta il tempo di esposizione a 20 ms.
2. Regolare il laser di imaging e le impostazioni di acquisizione fino a quando la fluorescenza GCaMP basale non si trova nella gamma media della gamma dinamica della fotocamera. Fare riferimento alla discussione per suggerimenti sull'ottimizzazione dei parametri di imaging utilizzando altre configurazioni di microscopia.
  NOTA: Per la configurazione ottica utilizzata in questo studio, impostare il laser di imaging a 488 nm sulle seguenti impostazioni di uscita: potenza laser = 50% e attenuazione = 1. Modificare le impostazioni di acquisizione aggiuntive come segue: guadagno EM moltiplicazione elettroni) = 200 e guadagno preamplificatore = 1.
3. Dopo aver individuato il neurite AVA utilizzando la fluorescenza GCaMP con un ingrandimento di 100x, impostare il correttore di deriva Z (ZDC, vedere la tabella dei materiali) su un intervallo di ±30 μm e avviare la messa a fuoco automatica continua. Correggere manualmente il piano focale secondo necessità prima dell'imaging.
4. Acquisisci un flusso di immagini con un ingrandimento di 100x. È possibile ottenere durate fino a 10 minuti con la configurazione utilizzata in questo studio.
Imaging mitoGCaMP in vivo
1. Segui i passaggi 2.1.1- 2.1.2 secondo necessità per acquisire la fluorescenza mitoGCaMP basale nella gamma media per la gamma dinamica della fotocamera.
  NOTA. Per la configurazione ottica utilizzata in questo studio, impostare il laser di imaging a 488 nm sulle seguenti impostazioni di uscita: potenza laser = 20% e attenuazione = 10. Modificare le impostazioni di acquisizione come segue: guadagno EM = 100 e guadagno preamplificatore = 2.
2. Dopo che i mitocondri nel neurite AVA sono stati localizzati utilizzando la fluorescenza mitoGCaMP, impostare lo ZDC come descritto sopra al punto 2.3.
3. Acquisisci un flusso di immagini con un ingrandimento di 100x.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Figura 1: Montaggio e rotolamento di C. elegans per l'imaging del cordone nervoso ventrale. (A) Un'illustrazione dei passaggi per preparare i tamponi di agar e raccogliere un singolo ...