Imaging della dinamica subcellulare del calcio nei neuroni di Caenorhabditis elegans

Abstract

Fonte: Doser, R., et al. Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo. J. Vis. Exp. (2023)

Questo video mostra l'imaging in vivo del flusso di calcio subcellulare nei neuroni del cordone nervoso ventrale dei ceppi transgenici di Caenorhabditis elegans. Vengono impiegati due indicatori di calcio distinti: un indicatore citoplasmatico in un ceppo e un indicatore mitocondriale in un altro. I neuroni vengono osservati al microscopio a fluorescenza per monitorare in tempo reale i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza all'interno del citoplasma neuronale e dei mitocondri, riflettendo il flusso di calcio durante l'attività neuronale spontanea.

Protocollo

1. Preparazione dei vermi per l'imaging

1. Preparazione dei tamponi di agar
   1. Make 3mL di agar al 10% sciogliendo l'agar di grado molecolare in M9 in una provetta di coltura di vetro da 13 mm x 100 mm e microonde per diversi secondi.
      NOTA. L'agar fuso può essere conservato su un blocco termico per un massimo di 1 ora o può essere preparato fresco ogni volta che sono necessari i tamponi di agar.
   2. Posizionare un vetrino da microscopio tra due vetrini aggiuntivi con due strati di nastro da laboratorio (vedere Figura 1A-i).
   3. Tagliare il puntale di un puntale per pipetta da 1.000....

Risultati

Figura 1: Montaggio e rotolamento di C. elegans per l'imaging del cordone nervoso ventrale. (A) Un'illustrazione dei passaggi per preparare i tamponi di agar e raccogliere un singolo .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
100x/1.40 Obiettivo olio	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Obiettivo	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Vetro di copertura	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Tavolo da laboratorio CleanBench	TMC		Con controllo delle vibrazioni
Ruota portafiltri o cursore	ASI		Per filtri da 25 mm di diametro
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Ceppo di vermi
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Ceppo di vermi
GFP filtro di emissione passa-banda	Chroma		525 ± 50 nm (diametro 25 mm)
Combinatore laser ILE	Andor Technologies		4 linee laser
Laser ILE a stato solido da 488 nm	Andor Technologies		50 mW
IX83 Microscopio confocale a disco rotante	Olympus		Con disco rotante Yokogawa CSU-X1
Fotocamera	iXon Ultra EMCCDAndor Technologies
Olio da immersione a bassa autofluorescenza	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Versione 7.10.1
Scatola di controllo del microscopio	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
Microsfere in polisfere	Poliscienze Inc.	00876-15	0,094 μm
Camera di stabilità	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Impostato a 15 °C
Stage controller	ASI		Con controllo a ruota portafiltri
Vetrino per microscopio standard	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Controller touch panel	Olympus		I3-TPC
Correttore di deriva Z	Olympus		IX3-ZDC2