Qui, descriviamo un protocollo per la purificazione del altamente attivi Hsp104, un esamerica AAA + proteine da lievito, che le coppie idrolisi dell'ATP per disaggregazione delle proteine. Questo schema sfrutta un costrutto His6-tag per la purificazione di affinità E. coli Seguita da cromatografia a scambio anionico, His6-tag rimozione di proteasi TEV, e le dimensioni di esclusione cromatografia.
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Articolo metodologico
Purificazione di Hsp104, una proteina Disaggregase
In questo articolo
Sommario
Abstract
Hsp104 è un esamerica AAA + 1 da proteine del lievito, che le coppie idrolisi dell'ATP alle proteine disaggregazione 2-10 (Fig. 1). Questa attività conferisce due vantaggi chiave selettiva. In primo luogo, rinaturazione di aggregati disordinati di Hsp104 consente la sopravvivenza di lievito, dopo varie sollecitazioni misfolding di proteine, tra cui shock termico 3,5,11,12. In secondo luogo, rimodellamento di cross-beta fibrille amiloidi da Hsp104 lievito permette di sfruttare una miriade di prioni (amiloidi infettive) come un serbatoio di benefici e ereditabile variazione fenotipica 13-22. Sorprendentemente, Hsp104 rimodella direttamente preamyloid oligomeri e fibrille amiloidi, compresi compresi quelli di proteine prioniche il lievito Sup35 e Ure2 23-30. Questo amiloide-rimodellamento funzionalità è un aspetto specializzato di lievito Hsp104. La E. ortologo coli, ClpB, non riesce a oligomeri preamyloid rimodellare o fibrille amiloidi 26,31,32.
Ortologhi Hsp104 si trovano in tutti i regni della vita tranne, stranamente, gli animali. Infatti, se le cellule animali possiedono un sistema enzimatico che le proteine coppie disaggregazione di rinaturazione (piuttosto che degrado) rimane sconosciuto 33-35. Così, noi e altri hanno proposto che Hsp104 potrebbe essere sviluppato come agente terapeutico per varie malattie neurodegenerative legate alla misfolding di proteine specifiche in oligomeri preamyloid tossici e fibrille amiloidi 4,7,23,36-38. Non ci sono trattamenti che riguardano direttamente la specie aggregate associati a queste malattie. Eppure, Hsp104 dissolve oligomeri tossici e fibrille amiloidi composto da alfa-sinucleina, che sono collegati con la malattia di Parkinson 23 così come le forme di PrP amiloide 39. Importante, Hsp104 riduce l'aggregazione delle proteine e migliora neurodegenerazione in modelli di roditori della malattia di Parkinson 23 e la malattia di Huntington 38. Idealmente, per ottimizzare la terapia e minimizzare gli effetti collaterali, Hsp104 sarebbe progettato e potenziato per rimodellare selettivamente aggregati specifici centrale per la patologia in questione 4,7. Tuttavia, la limitata comprensione strutturale e meccanicistica di come Hsp104 disaggrega ad un repertorio eterogeneo di strutture aggregate e proteine non correlate frustra questi tentativi 30,40-42.
Per comprendere la struttura e il meccanismo di Hsp104, è essenziale per lo studio della proteina pura e ricostituire la sua attività disaggregase con componenti minimi. Hsp104 è una proteina 102kDa con un pI di ~ 5.3, che hexamerizes in presenza di ADP e ATP, oppure a concentrazioni di proteine in assenza di 43-46 nucleotidi. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per la purificazione di molto attiva, stabile Hsp104 da E. coli. L'utilizzo di E. coli permette semplificata produzione su larga scala e il nostro metodo può essere eseguita in modo rapido e affidabile per Hsp104 numerose varianti. Il nostro protocollo aumenta Hsp104 purezza e semplifica la sua 6 tag rimozione rispetto ad un metodo di purificazione precedente da E. coli 47. Inoltre, il nostro protocollo è più facile e conveniente di due protocolli più recenti 26,48.
Protocollo
1. Espressione di Hsp104
- Il plasmide utilizzato per la purificazione in E. coli, pPROEX-HTB-Hsp104, contiene la Hsp104 open-lettura telaio sotto il controllo del promotore inducibile trc 26. Il plasmide produce Hsp104 con un N-terminale suoi 6-tag che possono essere rimossi per scissione della proteasi TEV. Trasforma pPROEX-HTB-Hsp104 in codone ottimizzato E. coli BL21-CodonPlus RIL-cellule (Stratagene, Agilent Technologies) utilizzando una procedura tipica trasformazione batterica (per esempio in base alle istruzioni del produttore). E 'importante utilizzare un codone ottimizzato E. coli ceppo Hsp1....
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Discussione
Timeline: per la massima attività Hsp104 raccomandiamo che il sistema di purificazione intero essere completato il più rapidamente possibile. Tuttavia, il numero di passaggi di purificazione rende un programma impegnativo che non può sempre essere pratico. Se le fasi di purificazione vengono eseguite più rapidamente possibile, il tempo a partire dalla fine di espressione durante la notte fino alle 2-4 ore di incubazione a 30 ° C con proteasi TEV è di circa 9-11 ore. Un posto potenziale per mettere in pausa sta se.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio del NIH (5T32GM008275-22) e un americano comunione Heart Association predoctoral (a EAS), una Chimica-Biologia Fellowship interfaccia dal NIH (2T32GM071339-06A1) (MED); e sovvenzioni da parte NIH (1DP2OD002177-01 e NS067354-0110), Il Ellison Medical Foundation e la Fondazione Bill e Melinda Gates Foundation (per JS).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| BL21-CodonPlus-RIL cellule competenti | Stratagene, Agilent Technologies | 230255 | |
| 2XYT brodo | USB | 75864 | |
| Completi, mini, EDTA senza inibitori della proteasi compresse | Roche | 1836170 | |
| Un pepstatina | Sigma | P4265 | |
| Ni-Sepharose 6 flusso veloce | GE Healthcare | 17-5318-02 | |
| Amicon Ultra-15 unità centrifughe filtro (MWCO 30.000) | Millipore | UFC903008 | |
| Risorsa Q - colonna 6ml | GE Healthcare | 17-1179-01 | |
| proTEV proteasi | Promega | V6052 | |
| AcTEV proteasi | Invitrogen | 12575015 | |
| Superose sei 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| Hsp40 | Assay Designs | SPP-400 | |
| Hsp72 | Assay Designs | ADI-NSP-555 |
Riferimenti
- Erzberger, J. P., Berger, J. M. Evolutionary relationships and structural mechanisms of AAA+ proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 93-114 (2006).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: A Novel Chaperone System th....
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Ristampe e permessi
