Quantificazione delle spine dendritiche mediante imaging al microscopio confocale

Abstract

Fonte: Gouder, et. al. Quantificazione tridimensionale di spine dendritiche da neuroni piramidali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video mostra l'imaging e l'analisi delle spine dendritiche in neuroni piramidali trasdotti e immunomarcati utilizzando la microscopia confocale. Il rumore di fondo è ridotto e i dendriti vengono tracciati stimandone il diametro e la lunghezza. La segmentazione automatizzata della colonna vertebrale comporta l'impostazione dei parametri per le dimensioni dei dendriti e della colonna vertebrale e la classificazione delle spine. Un modello 3D viene generato ed esportato per l'analisi.

Protocol

1. Coltura neuronale

1. Trattare piastre di coltura a 6 pozzetti con vetrini coprioggetti con poliornitina (diluita a 1/6 in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS), concentrazione madre 0,01%) durante la notte (O/N), seguita da tre lavaggi in DPBS. Quindi, aggiungere la laminina (concentrazione madre 1 mg/ml, diluita 500 volte in DPBS) per almeno 10 ore sotto la cappa di flusso.
2. Piastra e invio di cellule staminali neurali (NSC) a bassa densità (50.000 cellule/cm2) in piastre di coltura a 6 pozzetti con vetrini coprioggetti in 3 ml di terreno di coltura costituito da Dulbecco Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 o DMEM/F12 (500 ml), 2 fiale (5 ml ciascuna) di integratore di N2, 2 fiale (10 ml ciascuna) di integratore di B27, 10 ml di Pen-Streptomicina (Penicillina = 10.000 unità/ml e Streptomicina = 10.000 unità/ml), 1 ml di 2-mercaptoetanolo (Soluzione madre: 50 mM) e laminina (1/500), senza fattori di crescita.
   PASSAGGIO CRITICO: Eseguire questo passaggio con attenzione aggiungendo cellule con movimenti rotatori lenti per ridurre l'aggregazione cellulare.
3. Rimuovere il terreno di coltura. Aggiungere un terreno N2B27 fresco contenente 2 μg/ml di soluzione di laminina fresca per mantenere il neurone attaccato ai vetrini coprioggetti ed evitare la formazione di grumi. Cambia il mezzo ogni 3 giorni. Conservare una parte del terreno rimanente (200 μl) prima di aggiungere il terreno fresco per evitare che la cella si secchi. In alternativa, procedere rapidamente e modificare il volume totale (3 ml).

2. Nota sulla trasduzione lentivirale

: l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) è guidata dal promotore della fosfoglicerato chinasi (PGK) del topo. Per questo studio, il titolo virale era di 400 ng/μl (soluzione madre in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x).

1. Trasdurre le cellule staminali pluripotenti indotte umane o i neuroni derivati da iPSC in qualsiasi fase di maturazione mediante particelle virali aggiungendo 1 μl della soluzione madre contenente 40 ng di vettore lentivirale GFP per pozzetto di coltura (piastre a 6 pozzetti) e incubare per 48 ore in terreno di coltura fresco. Nota: Per questo protocollo, la durata dell'incubazione consente una buona etichettatura delle strutture della colonna vertebrale.

3. Nota sull'immunofluorescenza

: al fine di migliorare la marcatura dell'intera morfologia della colonna vertebrale, la marcatura in immunofluorescenza è stata eseguita utilizzando un anticorpo anti-GFP in condizioni permeabilizzate.

1. Rimuovere il terreno di coltura e fissare le cellule trasdotte sui vetrini coprioggetti in paraformaldeide al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente o RT, quindi lavare 3 volte in 1x PBS (10 min ciascuno).
2. Immergere i vetrini coprioggetti in PBS integrato con Triton allo 0,05% (100x) e siero di cavallo al 10% per 1 ora a RT, quindi lavare 3 volte in 1x PBS.
3. Aggiungere 100 μl di 1x PBS integrato con siero di cavallo al 4% e anticorpo primario (1/1.000) aumentato contro la GFP e diluito di un fattore 1.000 su ciascun vetrino coprioggetti. Incubare in una scatola scura O/N a 4°C, quindi lavare 3 volte con 1x PBS.
4. Diluire l'anticorpo coniugato Alexa Fluor 488 (1/200) in PBS integrato con lo 0,5% di Tween 20 e incubare per 1 ora a RT. Quindi, lavare 3 volte in 1x PBS e montare i vetrini coprioggetti su vetrini con un mezzo di montaggio per microscopia a fluorescenza.

4. Imaging della colonna vertebrale dendritica

1. Eseguire l'imaging confocale attraverso un microscopio confocale a scansione laser.
2. Selezionare neuroni sani con morfologia piramidale e un'arborizzazione dendritica completa e quantificare almeno 10 neuroni per condizione da esperimenti separati. Quantificare 60 - 100 μm per dendrite.
3. Acquisire immagini utilizzando un obiettivo a olio 40X NA = 1,3 e una linea laser a 488 nm per l'eccitazione GFP, con una potenza di picco tipica a livello di campione di circa 20 μW. Impostare la dimensione dei pixel intorno a 80 nm per campionare correttamente le spine dendritiche.
   Nota: L'analisi successiva richiede un'immagine in cui il rumore non comprometta la corretta segmentazione di dendriti e spine. Con il campionamento spaziale e le impostazioni di potenza menzionate sopra, abbiamo osservato che un tempo di permanenza dei pixel di 3,15 μs è sufficiente per raccogliere abbastanza fotoni per costruire un'immagine di questo tipo. Per i campioni deboli, la qualità dell'immagine può essere migliorata con una media di 2 o 4 scansioni. Potrebbe essere necessario l'acquisizione di diverse tessere XY per coprire la regione di interesse, che poi deve essere cucita insieme prima della lavorazione.
4. Per campionare l'intero volume del neurone, acquisire uno Z-stack con una spaziatura Z compresa tra 150 nm e 300 nm, producendo da 20 a 30 fette Z.
   Nota: La risoluzione spaziale laterale ottenuta con queste impostazioni è di 234 nm e la risoluzione assiale è di 591 nm. Il campionamento qui scelto è adeguato, ma poiché la risoluzione assiale è maggiore della dimensione più piccola delle spine da riprendere, l'analisi favorisce le spine che si estendono lateralmente dai dendriti.

5. 3D Quantificazione delle spine dendritiche

Nota: Le sezioni seguenti descrivono specificamente l'uso del software Imaris per l'analisi. Esistono implementazioni alternative, tra cui NeuronStudio o Metamorph, che possono fornire risultati simili.

Utilizzare le seguenti impostazioni chiave:

1. Come fase di pre-elaborazione, il filtro gaussiano viene utilizzato attraverso le funzionalità di elaborazione delle immagini offerte dal software. Eseguire il filtro gaussiano tramite l'elaborazione delle immagini > l'arrotondamento > filtro gaussiano. Impostate la larghezza del filtro in modo che corrisponda alla dimensione dei pixel in XY.
2. Eseguire un tracciamento semi-automatico dei dendriti utilizzando il modulo Filament Tracer del software.
   1. Innanzitutto, stima il diametro del dendrite utilizzando lo strumento distanza nella scheda Slice del software.
   2. Nella scheda Surpass, fai clic sullo strumento Filamenti. Per una migliore robustezza, questo protocollo si basa sul tracciamento semi-automatico; fare clic su Salta creazione automatica. L'interfaccia del modulo mostra ora la scheda Disegna. Qui, selezionare AutoPath come metodo, Dendrite come tipo e inserire il diametro stimato dei dendriti.
   3. Utilizzare la modalità di selezione del puntatore, trasformando il cursore in una casella. Maiusc-tasto destro del mouse sul punto iniziale del dendrite. Nota: il software esegue i calcoli iniziali.
   4. Sposta il puntatore lungo il dendrite. Dal punto di partenza (rappresentato da una sfera blu), viene mostrata una linea gialla che rappresenta il percorso dei dendriti più probabile. Maiusc-sinistro-clic sul punto finale del dendrite.
3. Eseguire la segmentazione automatica delle spine. Nota: Le spine sul dendrite tracciato devono essere trovate automaticamente dall'interfaccia del modulo.
   1. Nell'interfaccia del modulo, clicca sulla scheda Creazione. Nell'elenco a discesa Ricostruisci, selezionare Ricostruisci diametro dendrite e selezionare la casella Mantieni dati. Quindi fare clic su Ricostruisci.
   2. Impostare la soglia in modo che il volume segmentato corrisponda al volume effettivo dei dendriti. Come algoritmo, selezionare la distanza più breve dalla mappa delle distanze. Fare clic sul pulsante Avanti.
   3. Determinare il diametro più piccolo della testa della spina dorsale e la lunghezza massima, sempre utilizzando lo strumento distanza nella scheda Slice del software, quindi tornare alla scheda Surpass e inserire i parametri. Per questo protocollo, valori intorno a 200 - 300 nm per il diametro minimo e 4 μm per la lunghezza massima sono buoni punti di partenza. Non selezionare la casella Consenti spine di ramo. Fare clic sul pulsante Avanti.
   4. Regolare la soglia dei punti seme in modo che i punti blu che rappresentano le spine si localizzino nelle teste delle spine reali. Fare clic sul pulsante Avanti. Nota: il calcolo di base viene eseguito ora e può essere lungo.
4. Classifica i dorsi andando alla scheda Strumenti dell'interfaccia del modulo. Fare clic su Classifica dorso. Nell'interfaccia utente visualizzata, assicurarsi che siano presenti quattro classi, definite dalla loro morfologia come segue: Stubby: lunghezza <1 μm; Fungo: Lunghezza (spina dorsale) >3 e larghezza massima (testa) >larghezza media (collo) x 2; Lungo sottile: Larghezza media (testa) ≥ Larghezza media (collo); Filopodia-like: Lunghezza ≤ 4 μm (senza testa). Nota: L'interfaccia del modulo genera quattro nuovi oggetti Filamento contenenti i risultati della classificazione.
5. Esporta dati statistici: su una qualsiasi di queste quattro interfacce di oggetti, vai alla scheda Statistiche. Fai clic sul pulsante Esporta tutte le statistiche su file.
   Nota: Altri valori statistici possono essere esportati per dendriti (ad esempio, lunghezza, area, diametro medio, profondità del ramo, angolo di ramificazione, volume, ecc.) e spine (ad esempio, rettilineità, area di attacco, lunghezza e volume di parti distinte della colonna vertebrale, diametro della colonna vertebrale, densità, ecc.).

Materials