Method Article

Preparazione di Synaptoneurosomes da mouse Cortex con un discontinuo di Percoll-Saccarosio gradiente di densità

DOI:

10.3791/3196

⸱

September 17th, 2011

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin, 2Department of Biochemistry, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin

In This Article

Summary

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Un metodo per preparare traduzionali attivo, synaptoneurosomes intatto (SN) da topo corteccia cerebrale è descritto. Il metodo utilizza un discontinuo di Percoll-saccarosio gradiente di densità che permette per la preparazione veloce di SN attivo.

Abstract

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Synaptoneurosomes (SN) si ottengono dopo omogeneizzazione e frazionamento della corteccia cerebrale del mouse. Sono risigillati vescicole o terminali isolati che rompere con terminali dell'assone quando il tessuto corticale è omogeneizzato. La SN mantengono caratteristiche di pre-e post-sinaptici, che li rende utili per lo studio della trasmissione sinaptica. Essi conservano le macchine molecolari utilizzati nella segnalazione neuronale e sono capaci di captazione, stoccaggio, e il rilascio di neurotrasmettitori.

La produzione e l'isolamento di SN attivo può essere problematico media usando come Ficoll, che possono essere citotossici e richiedono estese a causa di centrifugazione ad alta densità, e la filtrazione e metodi di centrifugazione, che può portare a bassa attività a causa di danni meccanici del SN. Tuttavia, l'uso discontinuo di Percoll-saccarosio gradienti di densità per isolare SN offre un metodo rapido per produrre buone rese di SN traduzionali attivo. Il Percoll-saccarosio metodo del gradiente è veloce e gentile come impiega condizioni isotoniche, ha un minor numero di giri centrifugazione e più brevi ed evita le fasi di centrifugazione che SN pellet e provocare danni meccanici.

Protocol

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1. Preparativi 1-4

  1. Preparare 500 mL di tampone di media pendenza (GM) mescolando 50 mL di una sospensione saccarosio 2,5 M, 2,5 mL di una 1M Tris-HCl, pH7.5 stock, e 0,1 mL di una m 0,5 EDTA, pH 8,0 stock con millisecondi Q acqua al volume. Filtro sterilizzare la soluzione, aliquota e conservare congelati.
  2. Preparare uno stock 1000x di tetrodotossina (TTX) facendo una soluzione 1 mM in milli-Q H 2 O. Aliquote di TTX possono essere conservati a -20 ° C.
  3. Preparare Buffer 10x stimolazione facendo una soluzione di 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM KH 2 PO 4, 40 mM Na....

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Discussion

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Il discontinuo di Percoll-saccarosio preparazione pendenza qui descritto è un processo rapido, metodo affidabile per isolare attivo SN, che può essere utilizzato in una varietà di esperimenti di trasmissione sinaptica. Questo metodo del gradiente, che si basa sul metodo sviluppato da Dunkley et al. 3,4 è una procedura di frazionamento subcellulare del cervello che isola pre e post-sinaptici di membrana derivata vescicole che sono associati tra loro. Senza ulteriore purificazione queste SN sono compatibili con.......

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Disclosures

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

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Vorremmo ringraziare BK agosto presso la University of Wisconsin-Madison strumento microscopio elettronico per la microscopia elettronica. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01-DA026067 e P30-HD03352 (a JSM).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nome del reagente Azienda Numero di catalogo Commenti (opzionale)
Micro BCA Protein Assay Kit Perforare 23235
CaCl 2 Pescatore C79-500
Gas CO 2 Airgas (UW-MDS) CD 50
EDTA RPI E57020
EtOH Pescatore A407SK-4
HCl Pescatore A142-212
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
KH 2 PO 4 Pescatore P285-500
PierceSDS-PAGE kit di preparazione del campione Perforare 89888
NaCl RPI S23020
NaHCO 3 Pescatore BP328-500
Na 2 PHO 4 Pescatore S381-500
Saccarosio RPI S24060
Tris Base RPI T60040
Tetrodotossina Sigma T5651
Esprimere Label Pro Mix S35 Tag Facile Perkin Elmer NEG772
Attrezzatura Azienda Numero di catalogo Commenti (opzionale)
Strumenti di dissezione
Dounce omogeneizzatore, 7 ml (vetro viene fornito con due pestelli etichetta "A" e "B") Wheaton
P1000 Gilson Pipetman Gilson F123602
Allegra 6KR Centrifuga Beckman Coulter 366830
GH 3,8 rotore, rotore oscillante Beckman Coulter 360581
Beckman J2-21 Centrifuga Beckman
Beckman tubi con tappi Beckman 355672
Bianco adattatori murata Beckman 342327
Blu adattatori murata Beckman
JA-17 Rotor, Rotore ad angolo fisso Beckman 369691

Tabella di anticorpi utilizzati per Western blot:

Nome di anticorpi Azienda Numero di catalogo Specie Host Fattore di diluizione
β-Actina Sigma A5441 mouse 1:2000
GFAP Santa Cruz sc-65343 mouse 1:200
GP73 Santa Cruz Sc-134509 coniglio 1:200
HSC70 Santa Cruz sc-7298 mouse 1:200
Laminβ Santa Cruz Sc-6261 capra 1:200
Prohibitin Santa Cruz sc-28259 coniglio 1:200
PSD95 Millipore MAB1596 mouse 5 mcg / mL
SNAP25 AbCam ab5666-100 coniglio 1:2000
Sinaptofisina Millipore MAB368 mouse 1:500
β-3-tubulina Santa Cruz sc-80016 mouse 1:200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
  2. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic pr....

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SynaptoneurosomesMouse CortexPercoll Sucrose GradientDensity Gradient CentrifugationSynaptosome IsolationWestern Blot AnalysisS35 Methionine IncorporationProtein Translation StudiesSynaptic Vesicle UptakeNeurotransmitter Release

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