Un metodo per preparare traduzionali attivo, synaptoneurosomes intatto (SN) da topo corteccia cerebrale è descritto. Il metodo utilizza un discontinuo di Percoll-saccarosio gradiente di densità che permette per la preparazione veloce di SN attivo.
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Articolo metodologico
Preparazione di Synaptoneurosomes da mouse Cortex con un discontinuo di Percoll-Saccarosio gradiente di densità
In questo articolo
Sommario
Abstract
Synaptoneurosomes (SN) si ottengono dopo omogeneizzazione e frazionamento della corteccia cerebrale del mouse. Sono risigillati vescicole o terminali isolati che rompere con terminali dell'assone quando il tessuto corticale è omogeneizzato. La SN mantengono caratteristiche di pre-e post-sinaptici, che li rende utili per lo studio della trasmissione sinaptica. Essi conservano le macchine molecolari utilizzati nella segnalazione neuronale e sono capaci di captazione, stoccaggio, e il rilascio di neurotrasmettitori.
La produzione e l'isolamento di SN attivo può essere problematico media usando come Ficoll, che possono essere citotossici e richiedono estese a causa di centrifugazione ad alta densità, e la filtrazione e metodi di centrifugazione, che può portare a bassa attività a causa di danni meccanici del SN. Tuttavia, l'uso discontinuo di Percoll-saccarosio gradienti di densità per isolare SN offre un metodo rapido per produrre buone rese di SN traduzionali attivo. Il Percoll-saccarosio metodo del gradiente è veloce e gentile come impiega condizioni isotoniche, ha un minor numero di giri centrifugazione e più brevi ed evita le fasi di centrifugazione che SN pellet e provocare danni meccanici.
Protocollo
1. Preparativi 1-4
- Preparare 500 mL di tampone di media pendenza (GM) mescolando 50 mL di una sospensione saccarosio 2,5 M, 2,5 mL di una 1M Tris-HCl, pH7.5 stock, e 0,1 mL di una m 0,5 EDTA, pH 8,0 stock con millisecondi Q acqua al volume. Filtro sterilizzare la soluzione, aliquota e conservare congelati.
- Preparare uno stock 1000x di tetrodotossina (TTX) facendo una soluzione 1 mM in milli-Q H 2 O. Aliquote di TTX possono essere conservati a -20 ° C.
- Preparare Buffer 10x stimolazione facendo una soluzione di 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM KH 2 PO 4, 40 mM Na....
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Discussione
Il discontinuo di Percoll-saccarosio preparazione pendenza qui descritto è un processo rapido, metodo affidabile per isolare attivo SN, che può essere utilizzato in una varietà di esperimenti di trasmissione sinaptica. Questo metodo del gradiente, che si basa sul metodo sviluppato da Dunkley et al. 3,4 è una procedura di frazionamento subcellulare del cervello che isola pre e post-sinaptici di membrana derivata vescicole che sono associati tra loro. Senza ulteriore purificazione queste SN sono compatibili con.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare BK agosto presso la University of Wisconsin-Madison strumento microscopio elettronico per la microscopia elettronica. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01-DA026067 e P30-HD03352 (a JSM).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Perforare | 23235 | |
| CaCl 2 | Pescatore | C79-500 | |
| Gas CO 2 | Airgas (UW-MDS) | CD 50 | |
| EDTA | RPI | E57020 | |
| EtOH | Pescatore | A407SK-4 | |
| HCl | Pescatore | A142-212 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| KH 2 PO 4 | Pescatore | P285-500 | |
| PierceSDS-PAGE kit di preparazione del campione | Perforare | 89888 | |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| NaHCO 3 | Pescatore | BP328-500 | |
| Na 2 PHO 4 | Pescatore | S381-500 | |
| Saccarosio | RPI | S24060 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tetrodotossina | Sigma | T5651 | |
| Esprimere Label Pro Mix S35 Tag Facile | Perkin Elmer | NEG772 | |
| Attrezzatura | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Strumenti di dissezione | |||
| Dounce omogeneizzatore, 7 ml (vetro viene fornito con due pestelli etichetta "A" e "B") | Wheaton | ||
| P1000 Gilson Pipetman | Gilson | F123602 | |
| Allegra 6KR Centrifuga | Beckman Coulter | 366830 | |
| GH 3,8 rotore, rotore oscillante | Beckman Coulter | 360581 | |
| Beckman J2-21 Centrifuga | Beckman | ||
| Beckman tubi con tappi | Beckman | 355672 | |
| Bianco adattatori murata | Beckman | 342327 | |
| Blu adattatori murata | Beckman | ||
| JA-17 Rotor, Rotore ad angolo fisso | Beckman | 369691 |
Tabella di anticorpi utilizzati per Western blot:
| Nome di anticorpi | Azienda | Numero di catalogo | Specie Host | Fattore di diluizione |
|---|---|---|---|---|
| β-Actina | Sigma | A5441 | mouse | 1:2000 |
| GFAP | Santa Cruz | sc-65343 | mouse | 1:200 |
| GP73 | Santa Cruz | Sc-134509 | coniglio | 1:200 |
| HSC70 | Santa Cruz | sc-7298 | mouse | 1:200 |
| Laminβ | Santa Cruz | Sc-6261 | capra | 1:200 |
| Prohibitin | Santa Cruz | sc-28259 | coniglio | 1:200 |
| PSD95 | Millipore | MAB1596 | mouse | 5 mcg / mL |
| SNAP25 | AbCam | ab5666-100 | coniglio | 1:2000 |
| Sinaptofisina | Millipore | MAB368 | mouse | 1:500 |
| β-3-tubulina | Santa Cruz | sc-80016 | mouse | 1:200 |
Riferimenti
- Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic pr....
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Ristampe e permessi
