Visualizzazione del trasporto intracellulare di merci in astrociti in coltura

Abstract

Fonte: Creighton, B. A., et al. Visualizzazione e analisi del trasporto intracellulare di organelli e altri carichi negli astrociti. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video mostra la visualizzazione del trasporto intracellulare di merci in astrociti in coltura utilizzando una sonda acidotropica fluorescente che marca selettivamente le vescicole endolisosomiali acide. L'imaging time-lapse e l'acquisizione Z-stack con un microscopio confocale consentono il tracciamento del carico marcato in fluorescenza in tutto il volume tridimensionale della cellula. L'analisi differenzia il carico stazionario dal carico che si muove verso la periferia cellulare o il nucleo, fornendo informazioni sulle dinamiche del trasporto intracellulare.

Protocollo

1. Trasfezione di plasmidi marcati in fluorescenza

1. Il giorno prima della trasfezione o della marcatura, seminare gli astrociti alla densità desiderata per l'imaging 24-48 ore dopo la trasfezione. La densità consigliata per piastre da 24 pozzetti o pozzetti con fondo in vetro da 14 mm è di 2 x 104 cellule/pozzetto.
   NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per la trasfezione di astrociti placcati su vetrini di vetro da 12 mm su piastre da 24 pozzetti o pozzetti con fondo di vetro da 14 mm utilizzando un metodo basato sulla lipofezione. I reagenti devono essere scalati a seconda delle dimensioni della piastra di coltura in cui crescono gli astrociti.
2. Diluire il reagente di lipofezione (Tabella dei materiali) in terreni a siero ridotto (Tabella dei materiali). Per ottimizzare il rapporto tra il reagente di lipofezione e il DNA, testare una gamma di diluizioni adeguate. Ad esempio, se si utilizza il reagente impiegato in questo protocollo (Tabella dei materiali), diluire 2, 3, 4 e 5 μl del reagente di lipofezione in 50 μl di terreno sierologico ridotto.
3. Diluire 5 μg di DNA ad alta purezza in 250 μL di terreno sierologico ridotto. Aggiungere 5 μl di reagente potenziatore di lipofezione (Tabella dei materiali). Combinare il tubo contenente il reagente di lipofezione con un volume uguale della miscela di potenziatori di DNA e lipofezione. Miscelare mediante pipettaggio e incubare a temperatura ambiente (RT) per 15 minuti.
4. Rimuovere i terreni di coltura degli astrociti e aggiungere la miscela di trasfezione (passaggio 1.3) alle cellule goccia a goccia. Dopo un'incubazione di 6 ore a 37 °C e 5% di CO2, sostituire il complesso di trasfezione con un volume adeguato di terreno di coltura per astrociti (2 mL per piastre con fondo in vetro da 14 mm). Incubare per altre 24-72 ore prima di procedere all'acquisizione dell'immagine. Monitorare attentamente la durata della fase di incubazione per ottenere il miglior equilibrio tra espressione proteica e vitalità cellulare.

2. Marcatura di endosomi/lisosomi tardivi mediante sonde fluorescenti

NOTA: Alcuni carichi possono essere marcati utilizzando coloranti fluorescenti con elevata affinità per le proteine cargo-specifiche. L'esempio seguente consente la marcatura di endosomi/lisosomi tardivi con una sonda acidotropica fluorescente.

1. Diluire la sonda di marcatura lisosomiale (Tabella dei materiali) in 200 μL di terreno di coltura per astrociti a una concentrazione di lavoro di 1 μM e applicare agli astrociti dal passaggio 1.1 a una densità di 2 x 104 cellule/pozzetto. Incubare per 30 minuti a 37 °C.
2. Lavare le cellule una volta con terreni di coltura per astrociti caldi e sostituirle con terreni di imaging (Tabella dei materiali). Procedere immediatamente all'imaging dal vivo.

3. Acquisizione delle immagini utilizzando un sistema di imaging time-lapse

NOTA: L'imaging dal vivo time-lapse deve essere eseguito utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera ad alta velocità, messa a fuoco definita, camera di incubazione e un obiettivo a olio 40x con un'elevata apertura numerica (ad esempio, Plan-Apochromat 1.4NA). È disponibile una varietà di software di acquisizione per l'imaging time-lapse. La selezione del sistema di microscopia e del software di acquisizione deve essere basata sulla loro disponibilità e idoneità per gli obiettivi di un particolare studio. Di seguito vengono fornite alcune linee guida generali.

1. Posizionare la camera di coltura o il piatto nell'apposito adattatore sul tavolino del microscopio. Utilizzando la luce a epifluorescenza, selezionare le cellule che esprimono proteine fluorescenti o la sonda da registrare. Regolare l'illuminazione del campione fluorescente per visualizzare le celle selezionate utilizzando la fotocamera digitale. Evitare l'uso di un'illuminazione elevata che potrebbe causare fotosbiancamento e fototossicità. Regola la messa a fuoco e lo zoom.
2. Acquisisci una singola serie di time-lapse Z-stack a una frequenza di 1 fotogramma ogni 2 s per intervalli di tempo compresi tra 300 s e 500 s utilizzando le funzioni di zoom e messa a fuoco definita.
   NOTA: Le dinamiche di traffico (velocità, frequenza di movimento, ecc.) variano a seconda della proteina di interesse, quindi potrebbe essere necessario regolare il corso temporale dell'acquisizione. Ad esempio, i mitocondri sono meno mobili dei lisosomi e mostrano pause frequenti. In questo caso, è più opportuno regolare i parametri di acquisizione a 1 frame ogni 5 s per 800 s.
3. Salva le immagini time-lapse ed esportali come file stack AVI o TIFF.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetale Siero Bovino Gemini		100-106	Inattivato al Calore
FIJI (Fiji è solo l'immagine J)	NIH	Versione 1.52i
Pinzetta a punta fine	F.S.T	11254-20	Stile #5
Sorgente luminosa a fluorescenza	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
Piatti con fondo in vetro	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	Piatto da 35 mm | N. 1.5 Vetrino coprioggetti | Diametro del vetro 14 mm | Pinze Graefe non rivestite
	F.S.T	11054-10	Pinze Graefe Iris con punte curve
Colorante fluorescente verde che colora i compartimenti acidi (endosomi tardivi e lisosomi)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND 26. Pre-disciolto in DMSOS in una soluzione stock da 1 mM. Diluire fino alla concentrazione di lavoro finale nel terreno di coltura o nel tampone scelto.
Soluzione salina bilanciata di Hank (10x)	Gibco	14065-056	Senza magnesio e calcio
Imaging Media	Life Technologies	A14291DJ	Soluzione di imaging di cellule vive
Microscopio confocale invertito	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Reagente Lipofection Enhancer	Life Technologies	11514015	Plus Reagente
Lipofection Reagent	Life Technologies	15338100	Reagente Lipofectamina LTX
Incubatore con agitazione orbitale	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 , incubatore con agitazione orbitale con controllo della temperatura e della velocità
Soluzione di penicillina/strepomicina (100x)	Gen Clone	25-512
Soluzione salina tamponata con fosfato (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide	Sigma	P7405	Sciogliere in tampone Tris, pH 8,5, a 1mg/mL. Congelare per la conservazione a lungo termine. Evitare cicli di congelamento e scongelamento
Siero ridotto Terreno	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Fiasche per colture tissutali	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. Accesso al collo angolato al 100%, tappo filtrante ventilato idrofobico da 0,22 um
Incubatore per colture tissutali Thermo	Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, incubatore per colture tissutali con controllo
di temperatura, umidità e CO2Tris-Base	Sigma	T1503	8,402 g sciolto in un litro in acqua con 4,829 g Tris HCl per fare 0,1 M Tris tampone, pH 8,5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4,829 g sciolto in un litro in acqua con 8,402 g Tris Base per fare 0,1 M Tris tampone, pH 8,5

di coltura