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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Imaging a bioluminescenza del GL261 Sprayper la crescita
- tumorale una generosa quantità di disinfettante (soluzione di cloruro di dimetilammonio allo 0,05%) su un tovagliolo di carta pulito. Utilizzare il tovagliolo di carta imbevuto di disinfettante per pulire accuratamente il lenzuolo nero, i coni nasali e il divisorio all'interno della camera di imaging dove gli animali saranno a contatto con il dispositivo. Pulisci accuratamente tutte le superfici con un tovagliolo di carta pulito e asciutto. Ripetere l'operazione ancora una volta e attendere 5 minuti.
- Inizializzare la stazione di imaging.
- Anestetizzare il topo con una miscela da 300 μl contenente 200 μl di ketamina/xilazina e 100 μl di luciferina (sale di potassio D-luciferina, 150 mg/kg) mediante iniezione intraperitoneale.
- Attendere 10 minuti dopo l'iniezione e confermare se i topi sono completamente sotto anestesia pizzicando la coda. Per configurare il sistema di imaging, selezionare il binning "Luminescente", "Auto" e "Medio". Posiziona i mouse sulla stazione di imaging e fai clic sul pulsante "Acquisisci" per avviare l'immagine. Assicurarsi che il tempo dopo l'iniezione sia coerente con ogni sessione di imaging.
- Dopo che l'immagine è stata acquisita correttamente, dovrebbero essere visualizzate una finestra dell'immagine e una tavolozza degli strumenti. Fai clic sulla regione di interesse (ROI) o su "Strumenti ROI" e seleziona "auto" dall'icona del cerchio. Per definire le ROI, circondare l'area del segnale sull'immagine e quindi misurare la ROI come unità di fotoni/sec/sr/cm2.
- Portare i topi fuori dalla camera di imaging e monitorarli fino a quando non diventano deambulanti e mantengono la normale attività. In genere, il tempo di recupero è di circa 15 minuti. Non riportare i topi nella gabbia con altri animali fino a quando non si sono completamente ripresi dall'anestesia.
- Monitorare la crescita del tumore mediante imaging a bioluminescenza due volte alla settimana fino a quando gli animali presentano i seguenti sintomi: perdita di peso (perdita di oltre il 20% rispetto al peso prima dell'impianto), inappetenza (anoressia completa per 24 ore) e mancanza di una risposta intenzionale sostenuta a stimoli delicati (debole tentativo di alzarsi), momento in cui dovrebbero essere soppressi.
- Normalizzare i valori di luminescenza per ogni giorno rispetto alle letture corrispondenti ottenute il primo giorno di imaging a bioluminescenza (Figura 1A).
- Per l'analisi statistica, generare curve di sopravvivenza utilizzando lo stimatore Kaplan-Meier e confrontare le differenze tra le curve di sopravvivenza utilizzando un test log-rank.
