Imaging confocale tridimensionale ad alta risoluzione della barriera emato-encefalica in una sezione cerebrale di topo

Abstract

Fonte: Villaseñor, R e Collin. L. Imaging confocale ad alta risoluzione della barriera emato-encefalica: imaging, ricostruzione 3D e quantificazione della transcitosi. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra l'imaging 3D ad alta risoluzione della barriera emato-encefalica (BBB) utilizzando la microscopia confocale, mostrando sezioni cerebrali di topo colorate con anticorpi per analizzare i componenti della BBB e le strutture intracellulari, applicabili per lo studio dell'omeostasi cerebrale, delle interazioni neurovascolari e della disfunzione della BBB correlata alla malattia.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Imaging confocale ad alta risoluzione della barriera emato-encefalica
2. Eseguire l'acquisizione delle immagini con un microscopio confocale a scansione laser adatto (vedi Tabella dei materiali) con linee laser a 405, 488, 561 e 633 nm per l'eccitazione dei fluorofori nelle regioni blu, verde, arancione e rossa dello spettro luminoso. Per l'acquisizione delle immagini, utilizzare un obiettivo a olio 63X con un'apertura numerica di 1,4.
3. Nel menu di acquisizione del software che controlla il microscopio, impostare i parametri di acquisizione dell'immagine. Nel menu a discesa di "Dimensione immagine", seleziona un valore di 1024 x 1024 pixel. Modificare la dimensione dei pixel a un valore compreso tra 200 e 300 nm regolando il valore del menu 'Zoom'."
   NOTA: Per l'analisi delle strutture intracellulari, ridurre la dimensione dei pixel a 75 nm. Questa impostazione della dimensione dell'immagine aumenta notevolmente il tempo di acquisizione e può essere ridotta a 512 x 512 pixel per ridurre il tempo di acquisizione visualizzando un campo visivo più piccolo.
4. Nel menu a tendina "Velocità di acquisizione", selezionare un valore di 400 Hz, ovvero 400 linee al secondo. Nel menu "Impostazioni di sistema", seleziona il menu a discesa "Profondità pixel" e modifica il valore a 12 bit.
5. Nel software del microscopio, all'interno della scheda "acquisizione", attivare l'opzione per l'acquisizione sequenziale del fotogramma. Impostare lo spessore della sezione ottica su un valore compreso tra 0,75 e 1 μm per ciascun canale modificando il valore nel menu 'Pinhole'.
6. Nel pannello per l'eccitazione fluorescente, attivare il laser necessario per eccitare in modo ottimale i fluorofori nel campione, ad esempio una linea laser a 488 nm per un fluoroforo a emissione verde.
   NOTA: Utilizzare un visualizzatore di spettri fluorofori (vedere la tabella dei materiali) per selezionare il laser di eccitazione adeguato.
7. Nel pannello per il rilevamento della fluorescenza, spostare il cursore per selezionare le lunghezze d'onda che verranno misurate in ciascun canale, ad esempio, tra 510 e 550 nm per un fluoroforo che emette verde.
   NOTA: Utilizzare un visualizzatore di spettri fluorofori (vedere la Tabella dei materiali) per selezionare le lunghezze d'onda di rilevamento adeguate.
8. Aggiungere una goccia di olio da immersione con un indice di rifrazione di 1,52 sopra il vetrino coprioggetti con la sezione del cervello in modo che corrisponda all'indice di rifrazione del vetrino coprioggetti e dell'obiettivo. Posizionare il campione nel microscopio e accendere la lampada epifluorescente per visualizzare il campione utilizzando il binocolo del microscopio.
9. Utilizzando i pulsanti sul supporto del microscopio, sostituire la ruota portafiltri per selezionare un filtro appropriato per la visualizzazione di nuclei colorati con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo). Utilizzare la messa a fuoco grossolana per mettere a fuoco il segnale proveniente dai nuclei colorati DAPI.
10. Utilizzando i pulsanti sul supporto del microscopio, è possibile modificare i filtri per visualizzare il segnale proveniente dai marcatori vascolari (ad esempio, CollagenIV o CD31) e centrare il campo visivo su un singolo segmento capillare.
11. Premere il pulsante per avviare la modalità di scansione in tempo reale. Durante la scansione, regolare il guadagno e l'intensità del laser per ciascun canale per massimizzare la gamma dinamica delle immagini ed evitare la saturazione dei pixel.
    NOTA: Utilizzare una tabella di ricerca che etichetta i pixel saturi per valutare visivamente la sovrasaturazione. Per evitare la sovrasaturazione del segnale, regolare le impostazioni con il campione che si prevede abbia il segnale fluorescente più alto.
12. Impostare il valore per la media delle linee su 2.
    NOTA: Quando si utilizzano velocità di acquisizione più elevate, aumentare questo valore per ridurre il rumore.
13. Stabilisci le sezioni iniziali e finali per l'esecuzione di z-stack ottici che coprono l'intero volume del capillare. Utilizzare una dimensione del passo di 0,45 μm.
    NOTA: Se le immagini verranno utilizzate per la quantificazione successiva, mantenere le stesse impostazioni di acquisizione per l'intero set di dati.
14. Per la quantificazione, acquisire da 10 a 20 z-stack per sezione da almeno tre topi diversi per confronti statistici.
    NOTA: Acquisire l'intero set di dati nella stessa sessione per ridurre la variabilità derivante dallo sbiancamento del campione e dalle fluttuazioni dell'intensità del laser.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Clone di anticorpo monoclonale di ratto ER-MP12 contro CD31/PECAM	Novus Biologicals	MCA2388	Labels Brain Endothelial CellsUtilizzare alla diluizione 1:100rilevare con IgG policlonali anti-ratto d'asino (H+L) accoppiato con colorante AlexaFluor adatto, utilizzato alla diluizione 1:400
Anticorpo monoclonale di ratto contro la podocalyxin	Sistemi di ricerca e sviluppo	MAB1556	Etichette Lume dei capillariUtilizzare alla diluizione 1:100rilevare con asino policlonale anti-ratto IgG (H+L) accoppiato con il colorante AlexaFluor adatto, utilizzato alla diluizione 1:400
Anticorpo policlonale di coniglio contro il collageneIV	Biotrend	BT21-5014-70	Etichette Membrana basale dei capillariUtilizzare alla diluizione 1:100rilevare con IgG policlonali anti-coniglio d'asino (H+L) accoppiate con colorante AlexaFluor adatto, utilizzato alla diluizione 1:400
Anticorpo policlonale di capra contro i	sistemi di ricerca e sviluppo	AF2335	Etichetta i pericitiUtilizzare alla diluizione 1:100rilevare con IgG policlonali anti-capra d'asino (H+L) accoppiate con colorante AlexaFluor adatto, utilizzato alla diluizione 1:400
Clone di anticorpo monoclonale di topo G-A-5 contro GFAP accoppiato a Cy3	Abcam	ab49874	Etichette AstrocitiUtilizzare alla diluizione 1:100
Anticorpo policlonale di coniglio contro Iba-1	Wako	019-19741	Etichette MicrogliaUtilizzare alla diluizione 1:100rilevare con IgG policlonali anti-ratto d'asino (H+L) accoppiate con colorante AlexaFluor adatto, utilizzato a diluizione 1:400
Anticorpo monoclonale di ratto ABL93 gainst LAMP2	Fitzgerald	10R-CD107BBMSP	Etichette LisosomiUtilizzare a diluizione 1:100rilevare con IgG policlonali anti-ratto d'asino (H+L) accoppiate con colorante AlexaFluor adatto, utilizzato a diluizione 1:400
Anticorpo policlonale d'asino contro le IgG di topo (H+L) AlexaFluor594	LifeTechnologies	A21203	Utilizzare a diluizione 1:400
Anticorpo policlonale d'asino contro le IgG (H+L) di topo AlexaFluor488	LifeTechnologies	A21202	Utilizzare a diluizione 1:400
Anticorpo policlonale di capra contro le IgG di topo (H+L) AlexaFluor555	LifeTechnologies	A21422	Utilizzo a diluizione 1:400
Fluorescente Mezzo di montaggio	Dako	S3023	Mezzo di montaggio fluorescente Dako
Laser Scanning Microscopio confocale	Leica Microsystems	NA	Leica TCS SP8 X con rivelatori HyD e laser a luce bianca
Software di elaborazione delle immagini	Leica Microsystems	NA	Leica Application Suite AF versione 3.1.0 build 8587
Software di analisi delle immagini	Software scientifico Bitplane	NA	Imaris versione 7.6.5 build 31770 per x64
Fluorescence SpectraViewer	ThermoFisher Scientific	NA	https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html

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