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1. Celle di carico con perclorato di estere etilico tetrametilrodamina (TMRE)
NOTA: In questo protocollo, il TMRE viene utilizzato in modalità non quench a una concentrazione finale di 20 nM. In generale, si dovrebbe utilizzare la concentrazione più bassa possibile di TMRE che fornisca comunque un'intensità del segnale sufficiente sul microscopio scelto. A causa dell'evaporazione irregolare, il volume del terreno in diversi pozzetti può differire nelle colture primarie a lungo termine. Per garantire una concentrazione costante di TMRE in tutti i pozzi, non aggiungere TMRE direttamente ai pozzetti. Sostituire invece il terreno in ciascun pozzetto con la stessa quantità di terreno contenente TMRE. Il protocollo seguente è progettato per i neuroni primari in piastre a 24 pozzetti contenenti ~1 mL di terreno per pozzetto.
- Lavorando in una cappa a flusso laminare per colture tissutali, raccogliere 500 μl di terreno da ciascun pozzetto in un'unica provetta conica.
- Per ogni pozzetto, aggiungere 0,5 μl di TMRE da 20 μM nella provetta conica (ad esempio, 12 μl per 24 pozzetti).
- Aspirare con cautela il terreno rimanente dal primo pozzetto e sostituirlo con 500 μl di terreno contenente TMRE. Continuare, bene per pozzetto, con i pozzetti rimanenti.
NOTA: Fare attenzione a non lasciare che le cellule si secchino e a non disturbare le cellule. - Rimettere le cellule nell'incubatore e attendere almeno 60 minuti per l'equilibrio del colorante.
NOTA: Il tempo di caricamento può essere esteso a diverse ore senza effetti negativi. - Per garantire una concentrazione e un equilibrio costanti di TMRE durante l'esperimento di imaging, assicurarsi di includere una concentrazione finale di 20 nM di TMRE nel tampone di imaging e in tutte le soluzioni di stimolazione.
2. Ottimizzazione delle impostazioni del microscopio confocale a scansione
NOTA: Questa fase mira a trovare il miglior compromesso tra qualità dell'immagine e vitalità cellulare durante l'imaging dal vivo. Questa sezione descrive l'ottimizzazione delle impostazioni per l'imaging della proteina fluorescente verde sensibile alla riduzione e all'ossidazione (roGFP). Se si esegue l'imaging multiparametrico, è necessario eseguire un'ottimizzazione simile, incluso il controllo di una linea di base stabile senza segni di sbiancamento o fototossicità, per gli indicatori aggiuntivi.
- Avviare il microscopio confocale e caricare le impostazioni standard per l'imaging GFP (eccitazione 488 nm, emissione 505 - 550 nm).
- Impostare il rilevatore su 12 bit o 16 bit. nota: Di solito, 8 bit non sono sufficienti per l'imaging quantitativo.
- Attiva la modalità di scansione sequenziale e aggiungi una seconda sequenza/traccia (405 nm di eccitazione, 505 - 550 nm di emissione).
- Per entrambi i canali, selezionare una tabella di ricerca pseudocolore che indichi i pixel sovraesposti e sottoesposti (ad esempio, GLOW OU).
- Selezionare un obiettivo adatto all'oggetto di interesse.
NOTA: 10x-40x sono adatti per l'analisi di singole cellule, 63x-100x sono adatti per l'analisi di singoli mitocondri. - Montare un vetrino coprioggetti con cellule nella camera di imaging, aggiungere 1 mL di tampone di imaging e posizionare la camera sul microscopio.
- Utilizzare l'oculare e la luce trasmessa per mettere a fuoco le cellule.
NOTA: Non utilizzare la luce a epifluorescenza per localizzare e mettere a fuoco le cellule. Anche a bassa potenza, ciò influirà negativamente sulle celle. - Registra immagini con diversi formati di pixel. Sulla base di queste immagini, selezionare il numero di pixel più basso che fornisca una risoluzione accettabile della struttura di interesse.
NOTA: In genere, 512 x 512 pixel funzionano bene per l'imaging a cella singola con obiettivi 20x e 40x e 1024 x 1024 o 2048 x2048 pixel in genere funzionano bene per l'imaging a mitocondrio singolo con un obiettivo 63x. - Registra immagini con diverse dimensioni del foro stenopeico. Sulla base di queste immagini, selezionare la dimensione del foro stenopeico più grande che dia una risoluzione accettabile della struttura di interesse.
NOTA: In genere, 3-7 unità ariose funzionano bene. - Registra immagini con diverse intensità laser.
- Regola il guadagno e la soglia del rivelatore di conseguenza. Sulla base di queste immagini, selezionare l'intensità laser più bassa che fornisca un'intensità del segnale e un rapporto segnale/sfondo accettabili.
- Per determinare il rapporto segnale-sfondo, misura l'intensità del segnale in una regione di interesse (ROI) che contiene cellule o mitocondri (ROI1) e in una ROI senza cellule o mitocondri (ROI2). Quindi, dividere l'intensità della ROI1 per l'intensità della ROI2.
>NOTA: Puntare a un rapporto segnale-sfondo di >3 e intensità del segnale delle singole ROI di 200-1.000 per un'eccitazione di 405 nm con una potenza laser dell'1-3% e intensità delle ROI individuali di 300-1.500 per un'eccitazione di 488 nm con l'1% di potenza del laser.
- Registra immagini con diverse velocità di scansione e numero di medie di fotogrammi. Registra 4-5 immagini per ogni combinazione di impostazioni. Sulla base di queste serie di immagini, selezionare la velocità massima e le impostazioni medie più basse che forniscano un rumore dell'immagine accettabile e una variabilità da immagine a immagine.
NOTA: Nella maggior parte dei casi, una velocità di scansione di 600 Hz e 1-2 fotogrammi per la media funzionano bene. - Utilizzando un nuovo vetrino coprioggetti, registrare una serie time-lapse con le impostazioni ottimizzate.
NOTA: La durata e l'intervallo dell'immagine della serie dovrebbero assomigliare a quelli degli esperimenti pianificati. - Al termine della serie time-lapse, aggiungere 1 mL di soluzione 2x Diamide (DA) alla camera di registrazione. Immagine per altri 2 min.
- Aspirare il tampone di imaging utilizzando una pompa peristaltica o una pipetta portatile. Aggiungere 1 mL di soluzione 1x Ditiotreitolo (DTT). Immagine per altri 5 min.
- Analizza l'esperimento time-lapse.
- Verifica che nessuno dei due canali venga sovra o sottoesposto durante il trattamento DA e DTT con le impostazioni ottimizzate.
- Assicurarsi che nessuno dei due canali mostri uno sbiancamento considerevole durante la registrazione time-lapse; puntare a una perdita di intensità del <2% tra la prima e l'ultima immagine.
- Verificare che il rapporto 405:488 non cambi considerevolmente durante l'imaging.
- Ripetere l'intera procedura in modo iterativo, utilizzando diversi vetrini, fino a definire impostazioni che forniscano costantemente risultati accettabili.
3. Valutazione dello stato redox basale
- Avviare il microscopio e caricare le impostazioni ottimizzate dalla sezione 2.
- Impostare la media dei fotogrammi su 3-5.
- Montare un vetrino coprioggetti con cellule nella camera di imaging, aggiungere 1 mL di tampone di imaging e posizionare la camera sul microscopio.
- Utilizzare l'oculare e la luce trasmessa per mettere a fuoco le cellule.
NOTA: Non utilizzare la luce a epifluorescenza per localizzare e mettere a fuoco le cellule. Anche a bassa potenza, ciò influirà negativamente sulle celle. - Passa alla modalità di scansione e utilizza il canale a 488 nm in live view per mettere a fuoco e localizzare le cellule per l'imaging.
- Utilizzare la funzione multipunto per selezionare 3-5 campi visivi sul vetrino coprioggetti.
- Registrare un'immagine di base.
- Aggiungere 1 mL di soluzione 2x DA alla camera.
- Dopo 1, 2 e 3 minuti, utilizzare il live view per confermare/regolare la messa a fuoco e quindi registrare un'immagine.
NOTA: Le celle sono in genere completamente ossidate dopo 2 minuti. - Sostituire il tampone nella camera di imaging con 1 mL di soluzione 1x DTT.
- Dopo 3 e 5 minuti, utilizzare il live view per confermare/regolare la messa a fuoco e quindi registrare un'immagine.
NOTA: Le celle vengono in genere completamente ridotte dopo 4-5 minuti.
4. Imaging dal vivo dei trattamenti acuti
NOTA: Il protocollo seguente descrive l'imaging della risposta redox mitocondriale al trattamento NMDA. Potrebbe essere necessario regolare gli intervalli delle immagini e la durata dell'esperimento per altri trattamenti.
- Avviare il microscopio e caricare le impostazioni ottimizzate dalla sezione 3.
- Impostare l'intervallo di time-lapse su 30 s e la durata su 25 min.
- Montare un vetrino coprioggetti con le cellule nella camera di imaging, aggiungere 1 mL di tampone di imaging e posizionare la camera sul microscopio.
NOTA: Per evitare la deriva della messa a fuoco termica, lasciare le cellule sul tavolino del microscopio per 10-15 minuti prima di iniziare l'imaging time-lapse. - Utilizzare l'oculare e la luce trasmessa per mettere a fuoco le cellule.
NOTA: Non utilizzare la luce a epifluorescenza per localizzare e mettere a fuoco le cellule. Anche a bassa potenza, ciò influirà negativamente sulle celle. - Passa alla modalità di scansione e utilizza il canale a 488 nm in live view per mettere a fuoco e localizzare le cellule per l'imaging.
- Opzionale: per aumentare il numero di celle registrate per seduta, utilizzare la funzione multipunto per visualizzare 2-3 campi visivi per vetrino coprioggetti.
- Avviare l'acquisizione time-lapse e registrare 5 immagini come registrazione di base di 2 minuti.
- Aggiungere 500 μL di soluzione NMDA 3x alla camera (concentrazione finale 30 μM) e registrare altre 20 immagini come risposta NMDA di 10 minuti.
NOTA: I neuroni sono molto sensibili ai cambiamenti di osmolarità. Pertanto, assicurarsi di ridurre al minimo l'evaporazione del tampone di imaging. Per trattamenti più lunghi, la camera di imaging deve essere coperta con un coperchio. - Aggiungere 500 μl di soluzione 4x DA alla camera e registrare altre 6 immagini (calibrazione massima di 3 minuti).
- Aspirare il tampone dalla camera di imaging e sostituirlo con 1 mL di soluzione 1x DTT. Registra altre 10 immagini (calibrazione minima di 5 minuti).
- Terminare la registrazione e salvare la serie di immagini.