Imaging tridimensionale di astrociti immunomarcati mediante microscopia confocale

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Animali, chirurgia e preparazione dei campioni

NOTA: Preparare il tessuto cerebrale per l'analisi microscopica confocale tridimensionale (3D).

1. Dividere gli animali in modo casuale in due gruppi: amiloide-beta (Aβ)_1-40\iniezione (n = 8) e Aβ_1-40\iniezione con trattamento con genisteina (n = 8); somministrare genisteina (10 mg/kg diluiti in un veicolo come l'olio di ricino polietossilato) mediante sonda gastrica 1 ora prima dell'intervento.
2. Anestetizzare gli animali con ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Confermare la corretta anestesia dalla mancanza di riflesso di astinenza dopo aver pizzicato l'alluce. Usa un unguento sugli occhi durante l'intervento chirurgico per prevenire la secchezza.
3. Mettere gli animali nell'apparato stereotassico e radersi la testa. Applicare una soluzione di iodio per pulire il cuoio capelluto prima dell'incisione e mantenere il sito operatorio sterile durante l'intervento chirurgico per ridurre il rischio di infezione. Iniettare Aβ_1-40 stereotassicamente (4 μl) nell'ippocampo a -3,5 mm posteriormente al bregma, ± 2 mm lateralmente alla linea mediana e -2,8 mm sotto la dura, secondo l'atlante cerebrale del ratto.
4. Fornire osservazione/cura post-operatoria fino a quando gli animali non sono completamente coscienti per garantire il comfort degli animali. Tenere gli animali al caldo durante il recupero e non rimetterli in una gabbia con altri animali fino al completo recupero. Prestare attenzione a eventuali segni di infezione negli animali dopo l'intervento chirurgico.
5. Anestetizzare profondamente gli animali con ketamina (150 mg/kg) tre settimane dopo l'intervento chirurgico. Eseguire la fissazione transcardica perfondendo gli animali con soluzione fisiologica allo 0,9% seguita da paraformaldeide al 4% in soluzione salina tampone fosfato 0,1 M o PBS (pH = 7,4), quindi rimuovere e fissare il cervello.
6. Post-fissare il cervello in paraformaldeide al 4% per 2-3 giorni a 4 °C.
7. Incorporare il tessuto in blocchi di paraffina utilizzando apparecchiature per l'inclusione dei tessuti ed evitare di riempire in modo insufficiente o eccessivo la cassetta poiché potrebbe interferire con il corretto allineamento o sezionamento. Prestare attenzione all'orientamento del tessuto nel blocco di paraffina.
   NOTA: L'ippocampo di ratto, ad esempio, è vicino alla parte posteriore dell'emisfero cerebrale. Pertanto, il tessuto dovrebbe essere incorporato in modo che il sezionamento inizi nella parte posteriore del cervello. Usa l'atlante Paxinos come guida per raggiungere la struttura anatomica desiderata.
8. Posizionare il microtomo lontano da correnti d'aria o porte poiché i movimenti dell'aria rendono difficile la movimentazione delle sezioni.
9. Utilizzare sezioni con uno spessore ≥20 μm, poiché questa profondità sarà necessaria per produrre immagini Z-Stack di astrociti completi. Non utilizzare le prime due sezioni, poiché potrebbero avere uno spessore indesiderato a causa dell'espansione termica.
10. Posizionare le sezioni sulla superficie di acqua calda (5 ± 2 °C, al di sotto della temperatura di fusione della paraffina) il tempo necessario per appiattire le sezioni.
    NOTA: L'eccessiva espansione della sezione può disturbare la morfologia della struttura. Usa un pennello minuscolo per trasferire con cura le sezioni. Raccogli due o tre sezioni su ogni diapositiva.
11. Conservare i vetrini in una griglia verticale e lasciarli asciugare a 37 °C per diverse ore o durante la notte (O/N).

2. Immunoistochimica

1. Deparaffinare le sezioni in xilene, 2 x 10 minuti, e reidratare attraverso gradiente alcolico (99,8%, 95% e 70%, 10 minuti ciascuno) e PBS.
2. Incubare con anticorpi contro la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) diluita 1:1.500 in PBS contenente lo 0,25% di albumina sierica bovina (BSA), lo 0,25% di Triton X-100 e il 3,5% di siero normale (O/N a 4 °C).
3. Lavare le sezioni in PBS per 3 x 5 min.
4. Incubare con anticorpi secondari coniugati con fosfato alcalino per 1 ora (1:100, 21°C, diluiti in PBS).
5. Lavare le sezioni in PBS per 3 x 5 min.
   NOTA: È importante lavare accuratamente le sezioni dopo gli anticorpi secondari per ridurre al minimo la colorazione di fondo.
6. Incubare le sezioni al buio con il cromogeno rosso permanente liquido (15-20 min).
   Nota: Preparare la soluzione non più di 30 minuti prima dell'uso.
7. Lavare le sezioni in PBS per 3 x 5 min.
8. Infine, colorare i nuclei con 4-6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; 1:500, diluito in PBS) prima di coprire i costi. Conservare i vetrini in frigorifero per 24-48 ore prima della microscopia.

3. Microscopia confocale

NOTA: Per la valutazione quantitativa (vedi sotto), selezionare un astrocita con un nucleo colorato di DAPI chiaramente visibile con un minimo di rami sovrapposti per ridurre il rischio di errori. La produzione di immagini Z-Stack richiede molto tempo. Sii paziente e non fermarti durante la lavorazione. Un microscopio a scansione laser confocale verticale viene utilizzato per creare immagini 3D di astrociti.

1. Posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio e selezionare l'obiettivo 63X.
2. Aprire il software di imaging e fare clic su Avvia sistema. Fare clic sulla scheda Individua. Vai su Assegna e seleziona GFP per regolare la luce corretta.
3. Aprire l'otturatore per riflettere la luce. Trova il revolver del riflettore sul lato destro dell'otturatore e scegli il colore che deve essere riflesso dagli astrociti (verde, rosso o viola); il colore rosso (FSet20 wf) è stato utilizzato qui.
   NOTA: Non dimenticare di mettere a fuoco l'immagine direttamente nell'oculare del microscopio.
4. Per trovare la messa a fuoco migliore, fare clic su Tutto chiuso, mettere il perno del microscopio in modalità schermo e fare clic sulla scheda Acquisizione.
5. Fare clic su Smart Setup nella scheda Acquisizione; si apre una finestra. Seleziona il fluoroforo corretto (ad esempio DAPI e Alexa Fluor 555, nel progetto corrente) dall'elenco. Il colore viene selezionato automaticamente.
6. Fare clic su Miglior segnale e applicare, quindi fare clic su Imposta esposizione; il computer imposterà automaticamente i parametri di esposizione.
7. Per ottimizzare l'immagine, vai alla finestra Canali. Deseleziona Traccia2, evidenzia Traccia1 e fai clic su Live. Metti a fuoco l'immagine se necessario.
8. Nella finestra Canali regolare i seguenti tasti; fare clic su 1AU per ottimizzare automaticamente il foro stenopeico. È molto importante eseguire questo passaggio altrimenti le immagini confocali non saranno ottimali. Regola il guadagno per avere la migliore intensità (mantieni questa impostazione al di sotto di 800 per ridurre il rumore extra). Infine, imposta il guadagno digitale tra 2 e 3.
9. Deselezionare Traccia1, fare clic su Traccia2 e ripetere il passaggio 3.8 per Traccia2. Quindi interrompi Live.
10. Vai alla finestra Modalità di acquisizione. Migliora l'immagine ottimizzando le dimensioni del fotogramma e la media. Per modificare le dimensioni del fotogramma, vai su X*Y e seleziona 1.024 x 1.024. Scegli una velocità lenta per creare un'immagine migliore.
11. Vai su Media e seleziona un numero ≥4. Questo valore medio indica il numero di scansioni che verranno calcolate in media per produrre l'immagine acquisita. Ora, fai clic sul pulsante Snap e salva l'immagine 2D acquisita.
12. Per l'imaging 3D, contrassegnare l'elemento Z-Stack in Smart Setup, provocando l'apertura della finestra Z-Stack.
13. Imposta la prima e l'ultima posizione per lo Z-Stack, cioè la profondità della cella. Innanzitutto, fai clic su Live. Quindi utilizzare l'unità di messa a fuoco del microscopio per mettere a fuoco la posizione più alta dell'astrocita nel tessuto, dove deve iniziare lo Z-Stack. Fare clic su Imposta prima. Quindi, mettere a fuoco verso il basso fino alla posizione più bassa dell'astrocita nel tessuto, dove la scansione Z-Stack deve essere interrotta. Fare clic su Imposta ultimo. Quindi interrompi Live.
14. Scegliere l'intervallo; nello studio corrente viene utilizzato 1,01 μm; la scelta dell'intervallo può essere effettuata facendo clic su Ottimale per impostare il numero di fette.
15. Fai clic su Inizia esperimento. Salvare le immagini una volta completata la scansione. Questa immagine verrà utilizzata per la misurazione dei seguenti parametri: area superficiale e volume del territorio degli astrociti, nonché dell'intero astrocita, compresi i rami, il corpo cellulare e il nucleo.