Imaging in bioluminescenza in vivo di cellule progenitrici neurali umane in un cervello di topo

Abstract

Fonte: Weber, R. Z., et al., Trapianto intracerebrale e monitoraggio della bioluminescenza in vivo delle cellule progenitrici neurali umane nel cervello del topo. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video dimostra il metodo per l'imaging in bioluminescenza in vivo di cellule progenitrici neurali umane geneticamente modificate iniettate nel cervello di un topo. Il processo prevede l'iniezione di luciferina, la preparazione dell'imaging e il rilevamento di segnali bioluminescenti dalle cellule trapiantate nel sito di iniezione.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

Imaging in vivo

1. Preparazione di luciferina
   1. Scongelare il sale di potassio D-luciferina a temperatura ambiente (RT) e preparare una soluzione madre fresca di D-luciferina a 30 mg/mL in PBS.
   2. Sterilizzare la soluzione madre attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm.
      NOTA: Si consiglia l'uso immediato della soluzione di lavoro. Se necessario, la luciferina disciolta può essere conservata a -20 °C. Tuttavia, una memorizzazione prolungata può comportare il degrado del segnale. La luciferina è un reagente sensibile alla luce; Tienilo lontano dalla luce diretta quando possibile. Possono anche essere presi in considerazione substrati alternativi, ad esempio cycluc, per migliorare il limite di risoluzione.
2. Imaging
   1. Setup iniziale
      NOTA: L'imaging a bioluminescenza è stato eseguito utilizzando un sistema di imaging in vivo (vedi la Tabella dei Materiali) costituito da una camera oscura e una telecamera raffreddata con dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD).
      1. Fare doppio clic sull'icona del software Living Image e selezionare un ID utente dall'elenco a discesa.
      2. Fare clic su Inizializza nel pannello di controllo visualizzato. Una volta completato il processo di inizializzazione, la casella della temperatura nel pannello di controllo diventerà verde.
      3. Nel pannello di controllo, selezionare le caselle Luminescente e Fotografia e selezionare Esposizione automatica (~60 s). Selezionare un campo visivo (per questo protocollo è stato scelto D/12,5 cm). Immettere l'altezza del soggetto (1,5 cm) e selezionare l'opzione Usa messa a fuoco altezza soggetto. Impostare manualmente i seguenti parametri: big binning, f/2, filtro di eccitazione bloccato e filtro di emissione aperto.
   2. Determinare la quantità iniettabile di D-luciferina a 300 mg/kg di peso corporeo.
      NOTA: La dose standard raccomandata è di 150 mg/kg di D-luciferina. Questa procedura è stata regolata in base a un protocollo che riportava una sensibilità più elevata utilizzando 300 mg/kg.
   3. Iniettare la luciferina per via intraperitoneale (i.p.).
      NOTA: Se l'animale deve essere sedato prima dell'iniezione, tenere presente che potrebbe prolungare il tempo di espressione della luciferasi di picco.
   4. Attendere 5 minuti, quindi anestetizzare gli animali con una fornitura continua di isoflurano (4,5% nella fase di induzione e 1,5-2% nella fase di mantenimento durante la procedura di imaging).
   5. Applicare il lubrificante oftalmico sugli occhi, quindi radere gli animali sedati sulla regione della testa utilizzando un rasoio per capelli convenzionale. Posizionare gli animali nella camera di imaging e avviare l'imaging 15 minuti dopo l'iniezione di luciferina facendo clic su Acquisisci nel pannello di controllo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filtro siringa per materiali di
; 0.22 μm	TPP	99722
Attrezzatura
Sistema			di
imaging in vivo (IVIS Lumina III con pacchetto software Living Imaging 4.2)	Perkin Elmer	CLS136334
Vaporizzatore di isoflurano	Provet AG	330724
Farmaci e reagenti
D-luciferina Sale	di potassioPerkin Elmer	122799
Etanolo; 70%			Prodotto a scelta
Isoflurano (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluoromethyl-difluoromethyleter) 99,9%)	Provet AG	Tutti i prodotti farmaceutici sono stati forniti dalla farmacia cantonale di Zurigo, Svizzera
Lubrificante oftalmico (Retinol palmitat: 15.000 UI)	Bausch & Lomb Swiss AG	Tutti i prodotti farmaceutici sono stati forniti dalla farmacia cantonale di Zurigo, Svizzera

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