Contaminazione di preparati di ribosomi eucarioti purificata con metodi tradizionali da parte di co-purificazione nucleasi e proteasi influisce negativamente sulla valle analisi biochimiche e strutturali. Un metodo rapido e semplice purificazione cromatografica viene utilizzato per risolvere questo problema utilizzando ribosomi lievito come sistema modello.
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Articolo metodologico
Purificazione cromatografica dei ribosomi di lievito Highly Active
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ribosomi eucariotici sono molto più labili rispetto alle loro controparti eubatteri e archael, ponendo così una sfida significativa per i ricercatori. Particolarmente fastidioso è il fatto che la lisi delle cellule rilascia un gran numero di proteasi e nucleasi che può degradare i ribosomi. Quindi, è importante separare i ribosomi di questi enzimi nel più breve tempo possibile. Purtroppo, i metodi convenzionali ultracentrifugazione differenziale lascia ribosomi esposti a questi enzimi per periodi troppo lunghi di tempo, che influiscono sulla loro integrità strutturale e la funzionalità. Per risolvere questo problema, utilizziamo un metodo cromatografico utilizzando una cisteina carica Sulfolink resina. Questa applicazione semplice e rapida riduce in modo significativo le attività di co-purificazione proteolitici e nucleolytic, producendo rendimenti elevati di intatto, ribosomi lieviti altamente biochimicamente attivi. Suggeriamo che questo metodo dovrebbe essere applicabile anche ai ribosomi dei mammiferi. La semplicità diil metodo, e la purezza maggiore e l'attività del ribosoma cromatograficamente purificato rappresenta un progresso tecnico significativo per lo studio dei ribosomi eucarioti.
Protocollo
1. Preparazione di un cisteina carica Sulfolink resina
- Preparare Sulfolink resina (Pierce) a temperatura ambiente.
- Posizionare un totale di 10 ml di una emulsione al 50% di gel di accoppiamento Sulfolink come fornito dal produttore in due flaconcini da 10 ml in plastica, con 5 ml distribuito in ciascuna provetta.
- Centrifugare brevemente fiale a 850 xg e rimuovere con attenzione surnatanti.
- Lavare il gel tre volte in un tampone di accoppiamento (50 mM Tris, pH 8,5, 5 mM EDTA) da risospendere le perle in 5 ml, centrifugazione a 850 xg brevemente e rimuovere il surnatante tramite pipetta.
- Aggiungere cinque ml di una sol....
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Discussione
Protocolli di purificazione ribosoma fondamentalmente coinvolgere le cellule di lisi, raccolta una frazione citosolica da un testacoda a bassa velocità, e poi cubettatura ribosomi tramite centrifugazione ad alta velocità 1. Mentre un paio di nuovi metodi sono stati utilizzati per purificare i ribosomi batterici, lo stesso non fosse stato vero per eucarioti 2-4. Anche se ulteriori passi sono stati aggiunti nel corso degli anni, si lava sale ad esempio, e cuscini glicerolo (ad esempio vedi 5),
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Desideriamo ringraziare tutti i membri del laboratorio Dinman, tra Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, e Michael Rhodin per il loro aiuto e l'ingresso su questo progetto. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni a AM dalla American Heart Association (AHA 0630163N) e JDD dal National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL è stata sostenuta da un reinvestimento americano e Recovery Act del 2009, supplemento alla concessione genitore (3R01GM058859-11S1).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| Sulfolink Giunto in resina | Perforare | 20402 | |
| Mini bead-beater 16 | Biospec | 607 | |
| Optima Max E ultracentrifuga | Beckman Coulter | ||
| Legenda RT | Sorvall | ||
| Perle di vetro 0,5 millimetri | Biospec | 11079105 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 | |
| NH 4 Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Mg (OAC) 2 | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Glicerina | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Puromicina | Sigma-Aldrich | P7255 | |
| GTP | Fermentas | R0461 |
Riferimenti
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta
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Ristampe e permessi
