Spettroscopia Raman coerente anti-Stokes per visualizzare i neuroni mielinizzati nel tessuto cerebrale del topo

Abstract

Fonte: McCullagh, E. A., et al. Applicazione coerente della spettroscopia Raman Anti-Stokes (CARS) per l'imaging della mielinizzazione in fette di cervello. J. Vis. Exp. (2022)

Il video mostra la fluorescenza e l'imaging della spettroscopia Raman anti-Stokes coerente (CARS) per visualizzare l'architettura neuronale nel tessuto cerebrale dei roditori. La colorazione Nissl marca i corpi cellulari legandosi all'RNA ribosomiale, mentre l'imaging CARS prende di mira la mielina ricca di lipidi attraverso segnali indotti dal laser. La sovrapposizione delle immagini a fluorescenza e CARS fornisce una visione dettagliata dei corpi cellulari e degli assoni mielinizzati.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Colorazione di

1. sezioni flottanti libere per Nissl, per visualizzare i corpi cellulari (1:100), in terreni anticorpali (terreno AB: tampone fosfato 0,1 M (PB: 50 mM KH2PO4, 150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, 1% albumina sierica bovina (BSA)) per 30 minuti a temperatura ambiente su un agitatore da laboratorio standard.
   1. Proteggere le sezioni dalla luce utilizzando un foglio di alluminio e/o una copertura. Le lunghezze d'onda di 550 nm o inferiori sono compatibili con l'imaging CARS (Figura 1).
      NOTA: Sebbene non ci aspettiamo che Triton-X o altri reagenti abbiano un impatto sull'imaging CARS dei lipidi, potrebbero essere necessari controlli aggiuntivi con terreni anticorpali specifici.
2. PUNTO DI PAUSA: Conservare le sezioni flottanti (al riparo dalla luce) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) fino all'imaging. Una volta sezionato, l'imaging delle sezioni cerebrali entro 2 settimane.

2. NOTA di imaging

: la configurazione laser CARS contiene un laser a fibra che fornisce il clock a 80 MHz e un laser OPO (oscillatore parametrico ottico) con un intervallo sintonizzabile di 770-990 nm con il raggio Stokes fissato a 1031 nm, necessari per raccogliere il segnale CARS. C'è un'apertura per entrambi i raggi.

1. Prima di portare i campioni al microscopio, accendere e riscaldare il laser CARS per almeno 1 ora, allineare il laser CARS e Koehler l'ottica del condensatore e il diaframma del microscopio per l'imaging CARS in avanti.NOTA: Questo passaggio è fondamentale per il corretto funzionamento della microscopia CARS.
   1. Per l'allineamento spaziale dei due raggi laser (pompa e colpi), accedi ai due PSD interni (rilevatori sensibili alla posizione) tramite l'interfaccia grafica utente di CARS.
   2. Ottieni l'allineamento temporale utilizzando la funzione di ritardo nell'interfaccia grafica del laser CARS, che può aiutare a sovrapporre gli impulsi dei due laser (pompa e corse) che hanno dispersioni diverse a causa delle loro diverse lunghezze d'onda. Pertanto, sia la sovrapposizione temporale che spaziale dei raggi della pompa e dei raggi di corsa viene eseguita con l'input dell'utente attraverso la GUI.
   3. Regolare il periscopio esterno (gli ultimi due specchi della configurazione) per centrare i due laser spazialmente sovrapposti sugli specchi della testa di scansione del microscopio.
   4. Per il miglior rilevamento CARS non descanned, assicurarsi che il condensatore sia Koehler-ed (il che significa che il condensatore è centrato e focalizzato sul diaframma per ottenere un'illuminazione uniforme)
2. Per l'imaging confocale in immunofluorescenza e l'imaging CARS, è possibile dotare il laser CARS di rivelatori non descanned (NDD) sia in avanti che epi CARS, incorporando un microscopio confocale dotato di laser visibili per l'imaging a fluorescenza (Figura 2).
3. Posizionare le sezioni in un piatto di coltura con vetrino coprioggetti (per microscopia invertita), PBS per evitare che il tessuto si secchi e un peso di vetro per mantenere il tessuto vicino al vetrino coprioggetti.
4. Scatta z-stack o immagini singole con un obiettivo dell'acqua corretto a infrarossi 60X, 1,2 con apertura numerica (NA), che serve per la raccolta del segnale CARS nella direzione epi e attraverso un condensatore 0,55 NA nella direzione in avanti per l'imaging di aree cerebrali come il nucleo mediale del corpo trapezoidale (MNTB).
   1. Prendi le immagini CARS a circa 600 mW di pompa/sonda e 300 mW di Stokes, utilizzando l'interfaccia grafica laser di CARS. Questi valori di potenza del laser sono misurati internamente dal sistema. Le potenze di entrambi i laser nella posizione del campione sono inferiori a 25 mW e sono sicure per il campione di tessuto.
   2. Sovrapponi la pompa e le travi di Stokes spazialmente e temporalmente. Sintonizzare l'OPO su 797.2 nm. Ciò produce una lunghezza d'onda CARS di 650 nm. A causa del livello di energia più elevato, il ritorno risultante allo stato fondamentale è anti-Stokes (spostamento blu) all'eccitazione.
   3. Acquisizione del segnale CARS in rivelatori epi o forward non descanned utilizzando filtri passa-banda (640-680 nm) seguiti dal rilevamento sequenziale dell'etichetta di immunofluorescenza (in questo caso Nissl marcato in fluorescenza). nota: Il marcatore del soma neuronale di Nissl non viene catturato nel filtro passa-banda CARS 640-680 nm, consentendo la combinazione di fluorescenza e imaging CARS nelle immagini presentate di seguito.
   4. Le CARS e la fluorescenza non condividono le PMT. Utilizzare queste impostazioni per ottenere un segnale lipidico ottimale per visualizzare selettivamente la mielinizzazione nell'area del cervello. cautela: Proteggere l'utente dal raggio laser
5. Salvare le immagini come file .oib, che possono essere importati in un programma di analisi delle immagini per un'ulteriore quantificazione (Figura 3).

Risultati

Figura 1: L'imaging CARS può essere combinato con l'imaging immunofluorescente. I grafici mostrano che l'imaging CARS avviene a 660/640 nm di spettro del segnale rosso. Questa lunghezza d'onda è sufficientemente lontana dalla gamma verde, bl...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Staining:
AB Media:			1n 1.000 mL di Millipore H2O
Fosfato tamponato (PB):
Potassio Fosfato Monobase	Sigma	P5655
Sodium Phosohate Dibasic	Sigma	S7907
BSA (Albumina sierica bovina)	Sigma life science	A2153-100g
Cloruro di sodio	Fisher Chemical	s271-1
Triton X-100	Sigma - Aldrich	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS:
APE picoemerald laser	Angewandte Physik & Elektronik GmbH
filtro passa-banda (420-520 nm)	Chroma Technology	HQ470/100m-2P
passa-banda (500-530 nm)	Chroma Technology	HQ515/30m-2P
passa-banda filtri (640-680 nm)	Chroma Technology	HQ660/40m-2P
Microscopio confocale	Olympus	FV1000
Cut Transfer pipetta	Fisher	13-711-7M
dicroica passa-lungo 565 nm	Chroma Technology	565dcxr
dicroica passa-lungo 585 nm	Chroma Technology	585dcxr
dicroico passacorto 750 nm	Chroma Technology	T750spxrxt
piatto di coltura con fondo in vetro	MatTek	P35G-0-10-C
peso del vetro (asta boro 10 mm x 10 mm)	Allen Scientific Glass Inc
680 nm	Chroma Technology	ET680sp-2p8
PBS

filtro Filtro di emissione passacorto multifotone