Imaging della dinamica del calcio nelle cellule ciliate in linea laterale di larve di pesce zebra

Abstract

Fonte: Lukasz, D., et al. Imaging in vivo del calcio delle cellule ciliate della linea laterale in larve di pesce zebra. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra l'imaging dal vivo dell'afflusso di calcio nelle cellule ciliate della linea laterale di una larva di pesce zebra transgenico paralizzata utilizzando un microscopio confocale. La stimolazione meccanica dei fasci di capelli tramite impulsi di fluido induce l'ingresso di calcio attraverso i canali di meccanotrasduzione e i canali voltaggio-dipendenti, che viene visualizzato in tempo reale utilizzando indicatori di fluorescenza. Il metodo evidenzia le dinamiche apicali e basali del calcio nelle cellule ciliate di neuromasto, chiarendo il loro ruolo nel rilevamento del movimento dell'acqua.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Fissare e immobilizzare la larva alla camera di imaging
   1. Bagnare una larva Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) in circa 1 mL di tampone embrionale (E3) contenente lo 0,04% di MS-222 per 1-2 minuti sulla superficie dell'incapsulante in silicone della camera di imaging fino a quando la larva diventa immobile o non risponde al tatto.
      1. Sotto uno stereomicroscopio, posizionare la larva al centro della camera di perfusione in modo che poggi su un lato contro l'incapsulante in silicone.
         NOTA: Per coerenza, montare sempre le larve sullo stesso lato (ad esempio, lato destro verso il basso, lato sinistro verso l'alto) (Figura 2B1).
   2. Usando una pinza fine, portare un perno della testa da 0,035 mm perpendicolarmente alla larva e alla camera. Inserire il perno della testa tra l'occhio e la vescicola otica e verso il basso nell'incapsulante (Figure 1B1 e 1B2). Usa una seconda serie di pinze per stabilizzare la larva lungo il lato dorsale o ventrale durante il pinning. Assicurarsi che la parte orizzontale del perno entri in contatto con la larva e non prema fino in fondo nell'incapsulante. Inclinare il perno ventralmente (Figura 1B1) o puntarlo leggermente verso la parte anteriore del pesce per evitare di interferire con la successiva iniezione cardiaca e l'imaging delle cellule ciliate.
      1. Usando la pinza, inserisci un perno di coda da 0,025 mm nella notocorda il più vicino possibile all'estremità della coda (Figura 1B1).
         NOTA: Fai attenzione a evitare di allungare la larva. Appunta la larva piatta. Gli occhi devono essere sovrapposti (Figura 2B1). Questo è molto importante per facilitare l'iniezione cardiaca (Figura 1B2-B2', fase 3), facilitare un piano di imaging desiderabile (Figura 1B1-B2'', fasi 5) e quantificare l'intensità dello stimolo del getto di fluido (Figura 3A3, fase 4).
2. Iniezione di α-BUNGAROTOSSINA nella cavità cardiaca per paralizzare la larva

NOTA: Indossare guanti quando si maneggia la α-bungarotossina.

1. Centrifuga brevemente l'aliquota di α-bungarotossina prima dell'uso per evitare l'intasamento dell'ago per iniezione cardiaca.
   1. Riempire 3 μL di soluzione di α-bungarotossina in un ago per iniezione cardiaca utilizzando un puntale per pipetta di caricamento in gel. Caricare la soluzione in modo uniforme fino alla punta senza bolle.
   2. Inserire l'ago per iniezione cardiaca in un portapipette collegato a un micromanipolatore manuale. Sotto uno stereomicroscopio, posizionare l'ago in modo che sia allineato perpendicolarmente all'asse AP delle larve appuntate e anestetizzate, puntando verso il basso con un angolo di ~30°.
   3. Collegare il portapipetta all'iniettore di pressione. Applicare le seguenti impostazioni suggerite: Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0,5 s e Pcompensation = 5 hPa. Iniettare un bolo nella soluzione per verificare se la punta dell'ago è brevettata.
   4. Cerca un piccolo soffio della soluzione rossa (dal rosso fenolo) per lasciare la punta dell'ago. Se non si vede alcun colore rosso, raschiare molto delicatamente la punta dell'ago contro il bordo di uno spillo e riprovare fino a quando l'ago non è brevettato. In alternativa, tirare un ago con un'apertura della punta più grande.
2. Far avanzare l'ago verso il cuore fino a toccare la pelle al di fuori del cuore (Figura 1B2). Premere l'ago nella larva e cercare la rientranza della cellula del pigmento sulla pelle davanti al cuore per assicurarsi che l'ago sia posizionato sul piano corretto rispetto alla larva (Figura 1B2').
   1. Fai avanzare ulteriormente l'ago fino a quando perfora la pelle ed entra nella cavità cardiaca. Tira leggermente indietro l'ago. Iniettare un bolo di α-bungarotossina nella cavità cardiaca. Cerca il gonfiaggio della cavità cardiaca o il colorante rosso che entra nella cavità.
3. Sciacquare delicatamente la larva 3 volte con 1 ml di tampone neuronale (NB) per rimuovere il residuo di MS-222. Non rimuovere mai tutto il liquido. Mantenere la larva in circa 1 ml di NB sulla camera di perfusione.
   NOTA: Assicurarsi che il battito cardiaco larvale e il flusso sanguigno rimangano robusti dopo il pinning e l'iniezione del cuore e durante l'intero esperimento di imaging.
4. Preparazione del microscopio e configurazione del getto di fluido
   1. Assembla un microscopio confocale verticale utilizzando i componenti descritti nella Tabella dei materiali: un microscopio confocale con un laser da 488 nm e filtri appropriati, software del microscopio per controllare e coordinare l'imaging e la stimolazione, obiettivo ad aria 10x, obiettivo ad acqua 60x, scanner obiettivo piezo-Z (per z-stack), fotocamera ad alta velocità, camera circolare adattatore, tavolino motorizzato e adattatore per inserto tavolino.
   2. Assemblare il getto del fluido composto da 3 componenti principali: una pompa a vuoto e a pressione, una pinza a pressione ad alta velocità e uno stadio di testa (descritto anche nella Tabella dei Materiali). Utilizzare la pinza di pressione ad alta velocità per controllare i tempi e la durata della pressione o dello scarico del vuoto dallo stadio delle teste e nella pipetta a getto di fluido.
      1. Collega l'uscita dello stadio principale al supporto della pipetta a getto di fluido tramite un tubo di silicone a pareti spesse.
5. Allineamento di larve e getto di fluido

NOTA: Ci sono 3 piani di interesse all'interno di ciascun neuromast: (1) le punte dei fasci di capelli (Figura 3A3: i kinocilia, utilizzati per misurare l'intensità dello stimolo); (2) il piano di meccanotrasduzione dei fasci di capelli (MET) (Figura 2B1-B1': la base dei fasci apicali di capelli dove vengono rilevati i segnali di calcio dipendenti dal canale MET); e (3) il piano sinaptico (Figura 2B2-B2': dove i segnali presinaptici di calcio vengono rilevati alla base della cellula ciliata). Questi piani sono descritti nella Figura 2A.

1. Riempi 10 μL di NB in un ago a getto di fluido correttamente rotto utilizzando una punta di caricamento del gel. Caricare la soluzione in modo uniforme fino alla punta senza bolle. Inserire l'ago nel portapipette collegato al micromanipolatore motorizzato.
2. Posizionare la camera di perfusione in un adattatore circolare sul tavolino del microscopio. nota: Per coerenza, posizionare sempre la larva con lo stesso orientamento (ad esempio, la camera contenente la larva con il getto posteriore verso il fluido e il lato ventrale rivolto verso lo sperimentatore).
   1. Sposta il palco motorizzato in modo che la larva sia al centro del campo visivo. Ruotare l'adattatore della camera circolare in modo che l'asse anteroposteriore (AP) della larva sia approssimativamente allineato con la traiettoria dell'ago a getto di fluido.
   2. Utilizzando la luce trasmessa e il contrasto interferenziale differenziale (DIC), mettere a fuoco la larva e centrarla sotto l'obiettivo 10x. Aumenta l'obiettivo 10x.
3. Utilizzando il micromanipolatore motorizzato, portare l'ago del getto di fluido verso il basso al centro del campo visivo in modo che sia illuminato dalla luce trasmessa e tocchi appena la soluzione NB.
   1. Abbassa l'obiettivo 10x. Concentrati sulla larva per confermare la sua posizione. Concentrati verso l'alto per trovare l'ago del getto del fluido. Spostare l'ago a getto di fluido con il micromanipolatore sugli assi x e y fino a quando non si trova in una posizione parallela al lato dorsale del pesce.
   2. Concentrati di nuovo sulla larva. Portare l'ago verso il basso sull'asse z. Posizionare l'ago lungo il lato dorsale del pesce e a ~1 mm di distanza dal corpo (Figura 3A1).
   3. Spostare con cautela l'adattatore della camera circolare (se necessario) per assicurarsi che l'ago del getto del fluido sia allineato lungo la linea mediana A-P della larva (Figura 3A1).
   4. Spostare il tavolino motorizzato per posizionare il neuroalbero di interesse al centro del campo visivo. Tenere la punta dell'ago a getto fluido lungo il lato dorsale del pesce. Non toccare la punta dell'ago a getto di fluido con la larva o con la superficie della camera.
4. Passa all'obiettivo acqua 60x. Assicurarsi che l'obiettivo sia immerso nella soluzione NB. Utilizzare la messa a fuoco fine per localizzare un neuromast utilizzando la luce trasmessa e l'ottica DIC.
   NOTA: Questa configurazione è progettata per stimolare i neuromast lungo la linea laterale posteriore primaria. Le cellule ciliate all'interno di questi neuromasi rispondono al flusso di fluido diretto anteriormente o posteriormente.
   1. Posiziona l'ago a getto di fluido con il micromanipolatore in modo che si trovi a 100 μm dal bordo esterno del neuromast (Figura 3A2).
      NOTA: Scegli neuromast che offrano una chiara vista dall'alto verso il basso (Figure 2B1'-B2' e Figura 3A3) piuttosto che viste angolate lateralmente (Figura 2C1-C2). Una chiara vista dall'alto verso il basso consente l'imaging simultaneo di tutti i fasci di peli apicali in un unico piano ottico o l'imaging di aree sinaptiche in un numero inferiore di piani ottici (Figura 3A3).
   2. Focalizzare l'attenzione fino alle punte dei fasci di peli apicali (kinocilia) (Figura 1A, Figure 3A2 e 3A3). La parte inferiore dell'ago del getto di fluido dovrebbe essere a fuoco in questo piano.
5. Impostare la pinza di pressione ad alta velocità dalla modalità manuale a quella esterna per ricevere l'input dal software di imaging.
   1. Azzerare la pinza a pressione ad alta velocità premendo il pulsante "zero". Utilizzare la manopola del setpoint per impostare la pressione di riposo leggermente positiva (~2 mmHg). Confermare l'uscita di riposo della pinza di pressione ad alta velocità utilizzando un manometro per libbre per pollice quadrato (PSI) collegato all'uscita dello stadio di testa.
      NOTA: Impostare una pressione leggermente positiva a riposo per evitare l'assorbimento graduale del fluido nell'ago del getto del fluido nel tempo. Se il fluido entra nel tubo collegato al getto del fluido e raggiunge lo stadio di testa, può danneggiare l'apparecchiatura.
   2. Determina la pressione necessaria per stimolare i fasci di capelli. Utilizzare un ingresso da 0,125 e 0,25 V (6,25 e 12,5 mmHg) per 200–500 ms per applicare uno stimolo di prova (Figura 3A3-A3'').
      NOTA: La pinza di pressione ad alta velocità converte un ingresso di tensione (da software o altri dispositivi che si collegano alla porta BNC (Bayonet Neill-Concelman) sulla porta di comando della pinza di pressione ad alta velocità) in pressione che viene scaricata dallo stadio di testa, e, infine, l'ago a getto di fluido (1,0 V = 50 mmHg, mentre -1,0 V = -50 mmHg). In questa configurazione (vedere il passaggio 4.2) la pressione positiva (spinta) devia i fasci di capelli verso la parte anteriore e la pressione negativa (trazione) devia i fasci di capelli verso la parte posteriore.
   3. Utilizzando la luce trasmessa e l'ottica DIC insieme a una barra graduata, misurare la distanza di deflessione con gli stimoli 6,25 e 12,5 mmHg delle punte dei fasci di capelli, i kinocilia (Figura 2A e Figure 3A3-3''). Scegliere una pressione che sposti i fasci (come 1 unità coesiva) per una distanza di circa 5 μm (Figura 3A3''). Assicurati che le punte della kinocilia rimangano a fuoco per tutto il tempo.
   4. Spostare il getto di fluido ± 25 μm lungo l'asse A-P della larva per trovare una distanza e una pressione che deviano le punte della kinocilia di 5 μm.
      NOTA: Utilizzando GCaMP6s in larve 3-7 giorni dopo la fecondazione (dpf), una deflessione di 5 μm dovrebbe ottenere segnali di calcio GCaMP6s quasi saturanti e non dovrebbe danneggiare le strutture apicali del fascio di capelli (Figura 3A3''). Distanze di spostamento più piccole possono essere utilizzate per fornire stimoli non saturanti (Figura 3A3'). Le distanze di spostamento >10 μm sono difficili da stimare (Figura 3A3''') e possono essere dannose nel tempo. La saturazione del segnale dipende dall'età del neuromast (e dall'altezza cinenoiliale) e dall'indicatore utilizzato. Controllare periodicamente la pervietà dell'ago del getto del fluido in ciascuna direzione (pressione/spinta e vuoto/trazione) durante l'imaging. Gli aghi a getto di fluido si intasano facilmente e perdono la pervietà del vuoto, ma mantengono la pervietà della pressione residua. Utilizzare l'ottica DIC e un breve stimolo di prova in ogni direzione per verificare la pervietà del getto di fluido.
   5. Focalizzare il campione nel piano di interesse (ad esempio, la base dei fasci di capelli apicali o la base della cellula ciliata nel piano sinaptico; Figura 2B1-B2').
6. Procedura di acquisizione delle immagini: Acquisizione su un singolo piano

NOTA: Tutte le immagini descritte in questo protocollo vengono eseguite a temperatura ambiente (RT).

1. Imposta il software di imaging per acquisire un'acquisizione in streaming o continua a 80 fotogrammi con un'acquisizione ogni 100 ms per ottenere un frame rate di 10 Hz.
2. Imposta il guadagno, l'apertura e la potenza del laser per ottimizzare il rilevamento del segnale, ma evita la saturazione, il fotosbiancamento e il rumore. Le impostazioni di esempio per un Opterra/SFC sono le seguenti: 488 nm di potenza laser: 50 (piano MET a fascio di capelli), 75 (piano sinaptico); Fessura da 35 μm; guadagno = 2,7; Guadagno EM = 3900.
   NOTA: Applicare il binning 2 X se i segnali sono troppo deboli o rumorosi o presentano un eccessivo photobleaching. Il binning 2 X migliorerà il rilevamento del segnale a scapito della risoluzione spaziale.
3. Selezionare uno stimolo da erogare durante l'acquisizione di 80 fotogrammi (8 s) dopo il fotogramma 30, a 3 s.
   NOTA: Alcuni stimoli di esempio sono i seguenti: 200 ms (+ o - 0,25 V) fino a 2 s (+ o - 0,25 V) in direzione anteriore o posteriore per identificare la sensibilità direzionale di ciascuna cellula ciliata; 2 s, Onda quadra a 5 Hz (0,25 V per 200 ms, -0,25 V per 200 ms, ripetuta 5 volte) per stimolare tutte le cellule ciliate contemporaneamente. Una pressione positiva (stimolo anteriore) attiverà metà delle cellule ciliate. Una pressione negativa (stimolo posteriore) attiverà l'altra metà delle cellule ciliate. Assicurarsi che il software o il dispositivo di stimolo riporti la pinza di pressione a 0 V al termine dello stimolo.
4. Misura le risposte meccanosensibili al calcio. Concentrarsi sulla base dei fasci di capelli apicali (Figure 2A e 2B1-B1') e avviare l'acquisizione dell'immagine.
   NOTA: Se il neuromast è visto chiaramente dall'alto verso il basso (Figura 2B1-B1'), tutti i fasci di capelli apicali possono essere riprodotti contemporaneamente su un unico piano.
5. Misurare le risposte presinaptiche del calcio. Mettere a fuoco la base delle cellule ciliate (Figure 2A e 2B2-B2') e avviare l'acquisizione dell'immagine.
   NOTA: Se il neuromast è visto chiaramente dall'alto verso il basso (Figura 2B2-B2'), i piani di imaging presinaptico di tutte le cellule ciliate possono essere acquisiti in 2-3 piani distanti 2 μm. I pesci transgenici Tg[myo6b:ribeye-mcherry] possono essere utilizzati per identificare e localizzare nastri presinaptici e siti di ingresso del calcio.

Risultati

Figura 1: Camera di imaging, montaggio del pesce zebra e procedure di iniezione cardiaca e aghi. (A) Viene mostrata una camera di imaging con una larva (delineata da un rettangolo tratteggiato) appuntata al centro sopra l'incapsulante di sili...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
α-Bungarotoxin	R&D Systems	2133	Per paralizzare le larve prima dell'imaging
Camera di imaging	Siskiyou	PC-R	Piattaforma per montare le larve per l'imaging
No. 1.5 Vetrini coprioggetti quadrati, 22*22 mm	VWR	48366-227	Per sigillare la camera di imaging
Grasso siliconico per alto vuoto	Fischer Scientific	14-635-5D	Per l'apposizione del vetrino coprioggetto alla camera di imaging
Kit incapsulante in silicone trasparente da 0,5 g	Ellsworth Adhesives	Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0,5 KG	Per riempire la camera di imaging per creare una superficie per pinnare i pesci
Stereomicroscopio	Carl Zeiss Microscopia	Stemi 2000 con illuminazione a luce trasmessa	Per illuminare fili, pinze e forbici per fare spilli
Pinze fini	Strumenti	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) N. articolo 11295-10	Per fare spilli
Forbici fini	Cole-Palmer	5,5", EW-10818-00	Per tagliare il filo di tunggten per fare spilli Filo
tungsteno, 0,035 mm	Goodfellow	W005131	Per perni di testa per immobilizzare le larve
Filo di tungsteno, 0,025 mm	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	Per perni di coda per immobilizzare le larve
Capillari in vetro borosilicato senza filamento	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	Vetro da tirare in aghi a getto fluido per stimolare le cellule ciliate
Pinze fini	Fine Science Tools	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) N. articolo 11295-10	Per fissare le larve
Gel punte di caricamento	Eppendorf	5242956003	Per il riempimento degli aghi per iniezione cardiaca
Stereomicroscopio	Microscopia Carl Zeiss	Stemi 2000 con illuminazione a luce trasmessa Per	illuminare le larve durante il pinning e l'iniezione cardiaca Capillare
/portaago in vetro	WPI	MPH315	Per contenere aghi a getto di fluido
Micromanipolatore manuale	Narishige	M-152	Per il mantenimento e il posizionamento del portaago per iniettare la α-bungarotossina
Supporto magnetico	Narishige	GJ-1	Per il mantenimento del micromanipolatore manuale per l'iniezione di α-bungarotossina
Iniettore di pressione	Eppendorf	Femtojet 4x	Per erogare α-bungarotossina
Microscopio confocale	Bruker	Microscopio confocale a campo spazzato/Opterra	Microscopio fisso e verticale con ottica DIC e laser da 488 nm con filtri appropriati
Software per microscopio	Bruker	Prairieview 5.3	Per coordinare e controllare il microscopio, i laser, il tavolino, il piezo-z, le fotocamere e l'obiettivo
ad aria a getto fluido 10x	Nikon	MRH00101	Basso ingrandimento per il posizionamento delle larve e
l'obiettivo ad acqua a getto d'acqua 60x	Nikon	MRF07620	Obiettivo a immersione in acqua con NA elevato (1,0) e distanza di lavoro adeguata (2,0 mm)
Scanner obiettivo Piezo-Z con controller/driver	Strumenti Physik/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	Acquisizione z-stack ad alta velocità con precisione di 0,025um
Telecamera EMCCD	QImaging	Rolera EM-C2 Telecamera EMCCD	Fotocamera con pixel di piccole dimensioni in grado di acquisire fino a 100 fotogrammi al s
Adattatore	per camera circolareSiskiyou	PC-A	Per contenere e ruotare la camera di imaging sul tavolino del microscopio
Tavolino motorizzato del ponte	Z Prior Scientific	ZDN12MP	Tavolino del microscopio in grado di contenere e spostare il campione e il micromanipolatore con ago a getto di fluido insieme Adattatore per l'inserto
del tavolino del ponte a Z	NIH Officina meccanica	personalizzata	Per montare l'adattatore della camera circolare sul tavolino del ponte a
Z Apparato	a getto di fluidoALA scientific instruments	HSPC-1 Pinza di pressione ad alta velocità con pompa PV	Per il controllo e l'erogazione dello stimolo a getto di fluido
Tubo in silicone polimerizzato con perossido Masterflex (1 ft)	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	Per il collegamento del supporto dell'ago del getto di fluido alla pompa a pressione
Micromanipolatore motorizzato	Sutter Instrument Company	MP-225	Per il mantenimento e il posizionamento del supporto dell'ago per il fluido controller per
micromanipolatore	d'aria Sutter Instrument Company	MPC-200	Per il controllo del manipolatore ad aghi a getto di fluido
Punte di caricamento del gel	Eppendorf	5242956003	Per il riempimento degli aghi a getto di fluido
Capillare/porta ago in vetro	WPI	MPH315	Per contenere gli aghi a getto di fluido
Manometro PSI	Sper Scientific	840081	Per la misurazione uscita pinza di pressione
Prism7	Graphpad	Prism7	Software per tracciare le variazioni
FIJI	Schindelin, et., al.34	https://fiji.sc/	Software per elaborare immagini e creare mappe di segnale spazio-temporali
Turboreg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	Plugin per registrare sequenze di immagini GCaMP6 in FIJI
StackReg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/	Plugin per registrare sequenze di immagini GCaMP6 in FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin	Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA	a href='https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html'>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html	Plugin per creare più ROI per misurare le variazioni di intensità di GCaMP6

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