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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Preparazione
1. Stuzzicare ogni muscolo in piccoli fasci di fibre di circa 1 mm di larghezza utilizzando due pinze seghettate sottili.
NOTA: È fondamentale manipolare i muscoli molto delicatamente con il forcipe, senza forza eccessiva, per prevenire danni ai tessuti durante la presa in giro.
1. Dissocia il muscolo tibiale anteriore (TA) in 3 o 4 fasci a seconda delle sue dimensioni.
2. Per il gastrocnemio (GA), separa le parti mediale e laterale del muscolo e poi dissocia ogni parte in 4-5 fasci a seconda delle loro dimensioni.
2. Immunocolorazione
1. Procedere con la permeabilizzazione delle fibre muscolari: trasferire i fasci muscolari in piastre a 24 pozzetti contenenti l'1% (v/v) di Triton X-100 in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e tenerli in leggera agitazione (50 giri/min) per 1 ora a RT o 5 ore a 4 °C.
NOTA: Dividi i fasci muscolari tra due piastre per procedere con immunocolorazioni separate e per ridurre al minimo il rischio di confusione anticorpale. Non dividerli in più di due pozzetti (1 pozzetto/piastra); in caso contrario, il numero (N) di giunzioni neuromuscolari (NMJ) che sono rappresentative del loro stato generale nel muscolo analizzato potrebbe essere insufficiente.
2. Lavare i campioni 3 volte per 5 minuti con PBS a RT e incubarli con una soluzione bloccante composta al 4% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS/Triton X-100 1% per 4 ore a 4 °C, sotto leggera agitazione (50 giri/min).
NOTA: Non utilizzare una pompa di aspirazione durante le fasi di lavaggio, ma piuttosto aspirare la soluzione manualmente con una pipetta da 200 μL e puntali di piccole dimensioni (il riferimento è indicato nella Tabella dei Materiali).
3. Incubare i campioni per una notte (O/N) a 4 °C sotto leggera agitazione (50 rpm) con la soluzione bloccante indicata nel passaggio 2.2 contenente anticorpi monoclonali primari contro il neurofilamento M (NF-M, 2H3, diluizione 1/200) o la glicoproteina 2 della vescicola sinaptica (SV2, diluizione 1/200) per marcare rispettivamente i terminali degli assoni presinaptici o le zone attive.
4. Il giorno successivo, lava i fasci muscolari 3 volte per 5 minuti in PBS sotto agitazione (50 giri/min).
1. Per l'imaging confocale: Incubare i fasci muscolari con anticorpi secondari anti-topo coniugati con un fluoroforo emettitore di rosso (F594) (diluizione 1/500) e α-bungarotossina coniugato con un fluoroforo emettitore di verde (α-BTX-F488) (diluizione 1/1000) in PBS per 2 ore a RT sotto agitazione (50 rpm).
2. Per l'imaging con deplezione di emissione stimolata (STED): Incubare i fasci muscolari con anticorpi secondari anti-topo coniugati con un fluoroforo emettitore di verde (F488) (diluizione 1/500) e α-bungarotossina coniugata con un fluoroforo emettitore di rosso lontano caratterizzato da elevata fotostabilità (α-BTX-F633) (diluizione 1/1000) in PBS per 2 ore a RT sotto agitazione (50 rpm).
NOTA: Non esporre i campioni alla luce durante l'incubazione per evitare il fotosbiancamento.
5. Lava i fasci muscolari etichettati 3 volte per 5 minuti con PBS sotto agitazione (50 giri/min) e posizionali su un vetrino con un mezzo di montaggio.
NOTA: Posiziona un massimo di 4 o 5 fasci muscolari per diapositiva per consentire la sigillatura.
6. Aggiungi un vetrino coprioggetti in vetro di grado #1.5 (o #1.5H) (spessore 0.17 mm) sulla parte superiore e posiziona magneti cilindrici su entrambi i lati del vetrino per applicare pressione e appiattire i muscoli.
7. Mantieni le diapositive protette dalla luce O/N a 4°C. Sigilla le diapositive in modo permanente con lo smalto per unghie.
3. Acquisizione dell'immagine
1. Acquisizioni con un microscopio confocale
NOTA: Le immagini sono state raccolte con un microscopio confocale a scansione laser invertita utilizzando un obiettivo a immersione in olio di magnitudine 63x (HCX Plan Apo CS, apertura numerica 1.4 (NA)).
1. Per l'analisi in cieco, lascia che una persona non coinvolta nell'analisi codifichi ogni diapositiva con un dato numero. Rimanere all'oscuro dei gruppi sperimentali fino a quando la quantificazione dei parametri NMJ non sarà completa per tutti i campioni.
2. Avvia il software del microscopio in modalità di configurazione > >machine.xlhw.
3. Posiziona il vetrino sul tavolino del microscopio e trova il piano di osservazione all'interno del campione guardando sotto l'illuminazione a fluorescenza a campo largo DAPI con il set di filtri DAPI.
4.Clicca su Apri Progetto > Nuovi Progetti> e crea una cartella per memorizzare le acquisizioni di immagini.
NOTA: Crea un nuovo progetto per ogni NMJ per limitare le dimensioni della cartella e prevenire problemi di memoria del computer.
5. Per gestire i parametri di acquisizione, fai clic sulla finestra della scheda Acquisizione e imposta il foro stenopeico confocale su 1.0 Unità Airy e potenza laser per ottimizzare i livelli di guadagno e offset per la fluorescenza verde/F488 (α-BTX) utilizzando un laser a 488 nm sulla piastra terminale che deve essere ripreso (modalità Live ON).
6. Successivamente, ottimizza l'acquisizione della fluorescenza rosso/F594 (NF-M o SV2) utilizzando un laser adattato all'osservazione F594. In questo studio è stato utilizzato un laser a 552 nm (modalità Live ON). Impostare lo spettro di emissione del colorante con le seguenti gamme per ciascun laser: laser 405 (DAPI) da 414 a 483 nm, laser 488 (F488-α-BTX) da 506-531 nm e laser 552 (NFM/SV2) da 622-650 nm.
7. Raccogli pile di immagini di giunzioni neuromuscolari in ogni gruppo sperimentale con le stesse impostazioni: dimensione dell'immagine 1024 x 1024 pixel (73,7 x 73,7 μm) a frequenza di campionamento di 400 Hz, X bidirezionale ON, fattore di zoom 2,5, dimensione del passo Z 0,5 μm in modalità Z-Wide.
NOTA: Per ogni NMJ, il numero di fette è impostato per acquisire l'intera giunzione. Le impostazioni di acquisizione descritte sopra soddisfano il teorema del campionamento di Nyquist-Shanon. Tuttavia, l'utente può fare clic sul pulsante Ottimizza formato, presente su tutti i recenti software operativi confocali, per garantire che la dimensione dei pixel e il passo Z soddisfino la frequenza di campionamento di Nyquist ideale. Questa azione eviterà immagini sovracampionate o sottocampionate, che causeranno una perdita di precisione nelle misurazioni del volume.
8. Salva il file originale (.lif) o le immagini Z-stack (.tif) in una cartella con un nome che include il nome in codice della diapositiva, il tipo di colorazione e il numero della piastra finale.
NOTA: Raccogli in sequenza (non simultaneamente) le scansioni utilizzando i laser a 488 nm e 552 nm (F488 e F594) per evitare la diafonia della fluorescenza F488 nel canale F594 e viceversa (bleed-through). Il percorso del fascio può essere configurato con il Dye Assistant nel software del microscopio.
9. Passa alla diapositiva codificata successiva e ripeti i passaggi 3.1.3-3.1.8 per ogni NMJ.
10. Alla fine della sessione, clicca su Apri in Visualizzatore 3D e scegli un NMJ rappresentativo di un gruppo sperimentale per visualizzare l'etichettatura 3D.
NOTA: Questa modalità di visualizzazione aiuterà a verificare che i parametri di acquisizione siano corretti.
11. Chiudi il software del microscopio, pulisci gli obiettivi con i fazzoletti delle lenti, e poi spegni il sistema.
2. Acquisizioni con microscopia STED
NOTA: Le immagini sono state raccolte con un microscopio confocale a scansione laser invertita dotato di Gated STED a 775 nm utilizzando un obiettivo a immersione in olio 100x (HC PL APO CS2 1.4 NA).
1. Per l'analisi in cieco, lascia che una persona non coinvolta nell'analisi codifichi ogni diapositiva con un dato numero. Rimanere all'oscuro dei gruppi sperimentali fino a quando la quantificazione dei parametri NMJ non sarà completa per tutti i campioni.
2. Avvia il software del microscopio in modalità di configurazione > machine.xlhw e STED ON.
3. Fai clic su Apri progetto > Nuovi progetti per creare una cartella in cui archiviare le acquisizioni di immagini.
>NOTA: Genera una nuova cartella per ogni diapositiva per limitare le dimensioni della cartella e prevenire problemi di memoria del computer.
4. Posiziona il vetrino sul tavolino del microscopio e osservalo sotto l'illuminazione a fluorescenza ad ampio campo utilizzando il laser a 488 nm per trovare il piano di osservazione all'interno del campione.
5. Cerca un NMJ marcato con colorazione con neurofilamento M (NFM) o SV2 utilizzando il laser a 488 nm con un rilevamento spettrale da 506-531 nm.
6. Quando un NMJ è stato identificato, clicca su Attiva STED e inizia ad acquisire immagini in una regione che contiene diverse pieghe giunzionali utilizzando il laser a 635 nm con un rilevamento spettrale da 640-750 nm.
>NOTA: Fai attenzione alla tabella di ricerca della saturazione durante l'acquisizione dell'immagine e fai clic sul pulsante LUT rapida per evitare la sovraesposizione (valori di grigio >255; per 8 bit).
7. Raccogli le immagini di ogni gruppo sperimentale con le stesse impostazioni: dimensione dell'immagine 2048 x 2048 pixel (38.75 x 38.75 μm) a una frequenza di campionamento di 400 Hz.
NOTA: La potenza del laser di esaurimento (STED) è impostata al 65%.
8. Salva le immagini con un nome file che includa il codice della diapositiva.
NOTA: È possibile fare clic su Formato XY ottimizzato: Imposta formato per ottenere la migliore impostazione di acquisizione con l'imaging STED.
9. Passa alla diapositiva codificata successiva e ripeti i passaggi 3.2.3-3.2.8. Ripetere questa procedura per tutte le diapositive.
10. Alla fine della sessione di microscopia STED, trasferisci i file immagine su un altro computer e salva i file originali (.lif) in un'unità esterna o in un server.
11. Spegni il software del microscopio, pulisci gli obiettivi con i fazzoletti delle lenti, e poi spegni il sistema.