Imaging in vivo del trasporto del liquido cerebrospinale in un cervello di topo mediante macroscopia a fluorescenza

Abstract

Fonte: Sweeney, A. M., et al. Imaging in vivo del trasporto del liquido cerebrospinale attraverso il cranio di topo intatto mediante macroscopia a fluorescenza. (2019)

Questo video dimostra il processo di visualizzazione del flusso del liquido cerebrospinale (CSF) nel cervello di un topo utilizzando l'imaging a fluorescenza. Un tracciante fluorescente viene iniettato nella cisterna magna (CM), consentendo di tracciare il suo movimento con il liquido cerebrospinale attraverso gli spazi subaracnoidei e perivascolari. L'imaging time-lapse cattura il viaggio del tracciante, evidenziando la sua distribuzione nel tessuto cerebrale attraverso le arteriole.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione della cannula della cisterna magna, della piastra per la testa e del supporto per la testa

1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e le piastre per la testa prima dell'intervento chirurgico.
   NOTA: I traccianti fluorescenti vengono erogati direttamente nel liquido cerebrospinale tramite una cannulazione della cisterna magna.
2. In breve, utilizzando un cacciavite, rompere la punta di un ago da 30 G x 12,7 mm (1/2 pollice), a 3/4 di profondità, e posizionare l'estremità smussata dell'ago in un'estremità di tubo in polietilene 10 (PE10) (lungo circa 45 cm). Assicurarsi che solo lo smusso sporga dal bordo del tubo PE10.
3. Rompere 1/4 dell'estremità smussata di un altro ago da 30G e posizionare l'estremità smussata dell'ago rimanente nell'altra estremità del tubo PE10, con il Luer-lock di plastica ancora attaccato.
4. Riempire una siringa di vetro da 100 μl con liquido cerebrospinale artificiale sterile (aCSF: 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 2 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 10 mM di glucosio e 26 mM NaHCO₃).
5. Collegare la siringa all'estremità della linea e riempirla con aCSF fino a raggiungere la punta dell'ago smussato. È importante che la siringa sia riempita con aCSF e non con aria, poiché una colonna d'aria è più soggetta a volumi di infusione variabili.
6. Per gli esperimenti cronici, lasciare la riga piena di aCSF e saltare il passaggio 1.7.
7. Per esperimenti acuti, posizionare la siringa su una pompa per infusione e prelevare circa 5 mm di aria, che impedirà la miscelazione. Successivamente, prelevare il volume totale di traccianti desiderato per l'esperimento (si consiglia il 20% in più a causa delle perdite di spazio morto).
   NOTA: Il tubo PE10 deve essere sufficientemente lungo in modo che la bolla d'aria non entri nel bracciale di plastica della siringa di vetro durante il caricamento del tracciante. Per un tipico esperimento, il protocollo utilizza 10 μL di albumina sierica bovina coniugata ad Alexa Fluor 647 (BSA-647) diluita in aCSF allo 0,5%.
8. Verificare che la piastra per la testa si inserisca nel supporto per la testa e che sia della dimensione corretta per il mouse in uso. I marcatori anatomici per garantire ciò sono: il bordo superiore della finestra si allinea con la linea interoculare e il bordo posteriore cade rostrale rispetto alla cresta occipitale.
   NOTA: Le piastre per la testa in acciaio inossidabile possono essere sterilizzate e riutilizzate. La maggior parte delle miscele di cianoacrilato può essere rimossa con una soluzione di acetone.

2. Procedura chirurgica

1. Pesare e anestetizzare il topo (ad es. ketamina/xilazina; 100 mg/kg di ketamina, 10 mg/kg di xilazina; i.p.).
2. Una volta che il mouse non risponde più a un pizzicamento delle dita, inumidire il collo e la testa con acqua sterile e radersi con un tagliaunghie. Una volta rasata l'area, strofinare nuovamente l'area con un tampone imbevuto di alcol per rimuovere eventuali peli residui.
   NOTA: Inumidire il pelo prima di tagliare riduce drasticamente la quantità di peli nella finestra di imaging dopo l'incisione.
3. Posiziona il mouse in una cornice stereotassica sopra un tampone a temperatura controllata e applica un unguento oftalmico al petrolio sugli occhi del mouse per assicurarti che non si secchino.
4. Pulire la pelle esposta con un tampone di clorexidina. Dopo 2 minuti, rimuovere la clorexidina con una salvietta imbevuta di alcol. Infine, applicare una soluzione di iodio che può essere lasciata asciugare.
5. Iniettare analgesia sottocutanea (0,25% Bupivacaina HCl) nella parte superiore del cranio e del collo.
6. Partendo dalla parte del collo che copre la cresta occipitale, praticare un taglio della linea mediana nella pelle sovrastante e proseguire rostralmente verso la linea interorbitale. Incidere lateralmente fino al bordo dove il muscolo temporale si inserisce nel cranio. Rimuovere tutta la pelle dell'incisione fusiforme per esporre sia le ossa frontali che quelle parietali.
   ATTENZIONE: Il seno retroorbitale si trova caudale agli occhi e grandi rami della vena facciale posteriore si trovano rostrali al padiglione auricolare. Fare attenzione quando si esegue l'incisione per risparmiare queste strutture. Se ciò si verifica, interrompere l'emorragia mantenendo l'emostasi con un batuffolo di cotone sterile per diversi minuti e continuare.
7. Irrigare il cranio con soluzione fisiologica sterile e pulire la superficie con tamponi di cotone in modo che sia priva di detriti e peli poiché questi interferiranno con la qualità dell'immagine. La trasparenza del cranio è meglio preservata lasciando intatti il periostio e la fascia sovrastante.
   NOTA: Se queste strutture vengono rimosse accidentalmente, il cranio può diventare secco e opaco nel tempo. Inumidire nuovamente con aCSF o utilizzare una miscela di olio di paraffina e glicerolo per ridurre la riflettanza del cranio negli esperimenti acuti.
8. Procedere all'inserimento della cannula della cisterna magna.
9. Dopo aver inserito la cannula CM, applicare una miscela di cemento dentale con colla cianoacrilica sul lato ventrale della piastra della testa attorno al bordo e posizionarla sul cranio in modo che il bordo anteriore della piastra della testa si allinei con la punta posteriore dell'osso nasale e il bordo posteriore si allinei con l'aspetto anteriore dell'osso interparietale, assicurandosi che la sutura sagittale (linea mediana) sia centrata e diritta rispetto alla finestra (Figura 1B).
10. Fissare la posizione della piastra di testa utilizzando un paio di gocce di acceleratore di colla. Riempire gli spazi rimanenti con la miscela di cemento e polimerizzarla con l'acceleratore.
    ATTENZIONE: Assicurarsi che il cianoacrilato non entri in contatto con gli occhi del topo o ostruisca la finestra di imaging.
11. Incollare la cannula CM alla piastra della testa per assicurarsi che non si stacchi durante il trasporto o quando il mouse si sveglia.
12. Per gli esperimenti acuti, andare al passaggio 2.16.
13. Per gli esperimenti cronici, applicare uno strato sottile di colla cianoacrilica trasparente sul cranio esposto, facendo attenzione a non creare bolle in quanto interferiranno con l'imaging. La colla fornisce protezione per il cranio e non interferisce con l'imaging. Assicurati che la colla copra il cranio esposto fino alla pelle al bordo dell'incisione.
14. Utilizzare un morsetto per emostatico per tenere il tubo PE10 riempito con aCSF a 2-3 cm dal CM e tagliare la linea con una punta cauterica ad alta temperatura. Una volta separato, appiattire il tubo in PE10 fuso per sigillare la cannula.
    ATTENZIONE: Assicurarsi di non rilasciare il morsetto fino a quando la cannula non è stata sigillata e verificare che non vi siano perdite nel tubo per prevenire una fistola del liquido cerebrospinale.
15. Somministrare carprofene (5 mg/kg ogni 24 ore per 3 giorni; intraperitoneale [i.p.] o sottocutaneo [s.c.]) e riportare il topo in una gabbia a temperatura controllata, alloggiato in un unico alloggiamento, lasciandolo riprendersi per almeno 24 ore prima dell'imaging. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non riacquista sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Le finestre craniche intatte rimangono stabili per diverse settimane. NOTA: L'esperimento cronico può essere messo in pausa qui.
    ATTENZIONE: Alcune complicanze postoperatorie sono: cefaloematoma/ematomi subgaleali, fistola del liquido cerebrospinale e infezione.
16. Per gli esperimenti acuti, posizionare il mouse nel supporto per la testa utilizzando la piastra per la testa in modo che il cranio sia in una posizione fissa. Assicurati di controllare il livello di anestesia e posiziona un termoforo sotto il mouse. Il mouse è ora pronto per essere portato al macroscopio.
    ATTENZIONE: Trasportare con cura il mouse insieme alla pompa di infusione su un carrello. Se l'incannulamento CM si stacca, causerà un calo della pressione intracranica e qualsiasi perdita di liquido cerebrospinale altererà i risultati sperimentali.

3. Preparazione del mouse per l'imaging

NOTA: Il protocollo varia a seconda che l'esperimento di imaging venga eseguito su un mouse anestetizzato (iniziare dal passaggio 3.1) o sveglio (iniziare dal passaggio 3.2).

1. Topi anestetizzati
   1. Posiziona il supporto per la testa sul tavolino del macroscopio, assicurandoti che non ci siano pieghe nella linea dalla pompa a siringa alla cannula CM e che non sia teso poiché ciò potrebbe influire sull'infusione del tracciante.
   2. Osservare la frequenza respiratoria e la colorazione rosa delle mucose, che indicano una buona ossigenazione. Iniettare soluzione salina per via sottocutanea per garantire il livello di idratazione, se necessario. Verificare che l'animale sia sufficientemente anestetizzato e ridosare se necessario.
   3. Accendere la fotocamera macroscopica e il diodo a emissione luminosa (LED) e avviare la modalità LIVE.
   4. Confermare l'ingrandimento del campo di imaging in modo che la sutura nasofrontale nella parte superiore del campo e la sutura lambdoidea nella parte inferiore possano essere visualizzate chiaramente, con la sutura sagittale parallela e centrata al centro dell'immagine (Figura 1C). Una volta in posizione, fissare il supporto per la testa al tavolino del macroscopio con del nastro adesivo.
   5. Focalizzare il macroscopio sul cranio esposto. Nonostante i macroscopi abbiano una profondità di campo relativamente ampia, la curvatura del cranio del topo consente solo di mettere a fuoco un'area specifica. I migliori risultati si ottengono quando il piano focale si trova sui lati laterali delle ossa parietali posteriormente alle suture coronali.
      NOTA: Questa è la posizione delle arterie cerebrali medie (MCA), dove si verifica la maggior parte dell'afflusso di liquido cerebrospinale (Figura 1D, E).
2. Awake Mice
   1. Prima della sessione di imaging, lascia che gli animali si riprendano per almeno 24 ore dall'intervento chirurgico alla piastra della testa. Si consigliano anche periodi di recupero più lunghi (5-7 giorni). Durante questo periodo, addestrare il topo a fissare la testa sul tavolino nel tubo di ritenuta per 0,5-1 ora al giorno per tutta la durata del periodo di recupero.
      NOTA: L'assuefazione consente di attaccare il mouse al supporto della testa senza anestesia e riduce lo stress e l'ansia durante l'esperimento vero e proprio. Se ciò non è fattibile e l'anestesia non interferisce con l'esperimento, è possibile utilizzare una dose di induzione di un anestetico inalato (ad es. isoflurano 2% a 1-2 L/min di portata di O2) per collegare rapidamente il topo allo stadio della testa.
   2. Una volta fissato il mouse al supporto per la testa e nel tubo di ritenuta, seguire i passaggi 3.1.1-3.1.5.

4. Infusione di traccianti fluorescenti per il liquido cerebrospinale

1. Incannulamento CM acuto
   1. Poiché il tracciante era già stato caricato nella cannula prima di essere posizionato nella cisterna magna nel passaggio 1.6, impostare la pompa di infusione sulla velocità e sul volume desiderati. I paradigmi di infusione abitualmente utilizzati sono 5-10 μL a 1-2 μL/min, ma questi parametri possono essere regolati a seconda del particolare esperimento, o delle dimensioni e dell'età dell'animale.
2. Incannulamento CM cronico
   1. Prima di iniziare la sessione di imaging, segui i passaggi 1.2-1.7 per esperimenti acuti per preparare la linea di infusione per erogare i traccianti.
   2. Una volta preparata la linea, utilizzando una pinza per emostatico tagliare l'estremità sigillata della cannula CM cronica. Prelevare l'ago dalla linea preparata al punto 4.2.1 e inserirlo delicatamente nella cannula. Rilasciare il morsetto e, utilizzando la pompa a siringa, far avanzare il tracciante CSF alla velocità di infusione desiderata (ad es. 2 μL/min) per l'esperimento fino a quando il tracciante non raggiunge l'ago impiantato nel CM.
      ATTENZIONE: Se l'ago perfora il tubo durante il collegamento della linea, rimuovere l'ago, tagliare il segmento perforato e ripetere questo passaggio. Qualsiasi strappo nel tubo PE10 causerà una perdita e influenzerà i risultati dell'esperimento.

5. Impostazione della sessione di imaging

1. In base al tracciante fluorescente da infuso, determinare la lunghezza d'onda di eccitazione e il tempo di esposizione per ciascun canale. Scegliere il tempo di esposizione più breve necessario per visualizzare il tracciante al fine di massimizzare la risoluzione temporale dell'imaging time-lapse. Questo tempo di esposizione sarà utilizzato per tutti gli esperimenti successivi volti a confrontare il trasporto di CSF tra diversi animali.
   NOTA: Un consiglio è quello di utilizzare il tracciante nella linea CM per regolare il tempo di esposizione. Sebbene questo sia un primo approccio utile, dovrebbe essere ottimizzato nel tempo.
2. Scegli la durata dell'esperimento e gli intervalli con cui verranno acquisite le immagini. Gli esperimenti durano normalmente tra i 30 e i 60 minuti a seconda della fase del trasporto glinfatico di interesse. Frame rate di 1 fotogramma/min e superiori sono sufficienti per la maggior parte degli esperimenti.
3. Impostare il nome del file e la directory di salvataggio.
4. Se l'imaging verrà raccolto in aggiunta all'acquisizione simultanea di altre variabili (ad es. elettrocardiogramma, pressione arteriosa, elettrofisiologia), il macroscopio e la pompa possono essere programmati per essere attivati con il software di acquisizione dati. Verificare che la funzione di attivazione sul macroscopio sia corretta prima di passare al passaggio successivo.

6. Esperimento di imaging ottico transcranico

1. Iniziare contemporaneamente l'infusione del tracciante e l'imaging.
2. Controllare regolarmente la cannula CM e il tubo PE10 per eventuali segni di perdita. Se c'è qualche tracciante che fuoriesce dal CM, i risultati di questo esperimento devono essere esclusi.
   NOTA: Se il tracciante inizia ad accumularsi nel cervelletto e non percorre la via glinfatica delle arterie cerebrali medie (MCA), è probabile che la cannula CM sia stata iniettata nel cervelletto. Questi dati non devono essere inclusi.
3. Per gli esperimenti acuti, dopo il completamento dell'esperimento, rimuovere il topo dal microscopio e verificare che sia ancora adeguatamente anestetizzato. Decapita rapidamente il topo e raccogli il tessuto cerebrale. Fissare per immersione il cervello in paraformaldeide (PFA) al 4% durante la notte a 4 °C.
   1. Per gli esperimenti cronici, una volta completato l'imaging, rimuovere la linea CM dalla cannula, sciacquare con aCSF sterile e richiudere la cannula CM con una punta cauterica ad alta temperatura. Rimuovi il mouse dal supporto per la testa e rimettilo nella sua gabbia. Ripetere questo processo fino a quando non sono necessarie ulteriori immagini e quindi seguire il passaggio 6.3.

Risultati

Figura 1. Imaging macroscopico transcranico. (A) Schema dell'impostazione dell'imaging macroscopico. (B) Vista dorsale della posizione della piastra della testa sul cranio. L'osso interparietale e le ossa...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0.25% Bupivacaine HCl			University of Rochester Vivarium
100 μL Siringa a tenuta di gas Modello 1710 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81020
A-M Systems Polvere	di cemento dentaleFisher Scientific NC9991371
Carprofen			Università di Rochester Vivarium
Clorexidina	Prevantics	B10800
CMOS Camera	Hammamatsu	ORCA Flash 4.0
Piastra	di testa Università di Rochester	Nessun catalogo #	Custom made in the machine shop at the University of Rochester
Cauterina ad alta temperatura	Bovie Medical Corporation	AA01
Insta-set Acceleratore	Bob Smith Industries	BSI-151
Isoflurano - Fluriso	Vet One	502017	Università di Rochester Vivarium
Ketamina			Strong Memorial Hospital Farmacia
Krazy Colla	Elmer's Products, Inc	Nessun catalogo #, vedi il link nei commenti	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Nastro chirurgico Micropore	Fisher Scientific	19-027-761
Paraformaldeide	Sigma-aldrich	P6148
PE10 - Polietilene .011" x .024" per piede, 100 piedi continuo	Braintree Scientific	PE10 100 FT
Pompa 11 Elite Infusion Solo doppia siringa	Apparecchio Harvard	70-4501
PURALUBE UNGUENTO VETERINARIO	Dechra
Puritan PurSwab Bastoncini per la pulizia con punta in cotone	Fisher Scientific	22-029-553
Microscopio macro zoom da ricerca	Olympus	MVX10
Piastra portatesta semplice (per topi)	Narishige International USA Inc	MAG-1
Aghi monouso, BD Medical	VWR	BD305106
Tamponi sterili per la preparazione dell'alcol	Fisher Scientific	22-363-750
LED sintonizzabile	PRIOR Lumen 1600-LED
Xilazina			Università di Rochester Vivarium