Trapianto transnasale di cellule microgliali umane derivate da cellule staminali pluripotenti indotte nel cervello di topo

Abstract

Fonte: Parajuli, B., et.al. Trapianto di microglia derivate da cellule staminali pluripotenti indotte umane in cervello di topi immunocompetenti per via transnasale non invasiva. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video mostra il trapianto transnasale di cellule di microglia umana derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSMG) in un cervello di topo. La ialuronidasi viene applicata alle narici di un topo impoverito di microglia per migliorare la permeabilità. La sospensione di iPSMG viene somministrata per via intranasale e il topo può riprendersi. I terreni ricchi di fattori di crescita vengono somministrati regolarmente per supportare la sopravvivenza dell'iPSMG nel tessuto cerebrale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione del terreno cellulare, del terreno di trapianto e della miscela per anestesia

1. Preparare il terreno cellulare aggiungendo il 10% di siero fetale bovino e lo 0,1% di penicillina/streptomicina nel terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM).
2. Preparare il terreno di trapianto aggiungendo al terreno cellulare il fattore stimolante le colonie umane 1 o hCSF1 (250 ng/mL) e il fattore di crescita trasformante umano beta 1 o hTGF-β1 (100 ng/mL).
3. Preparare la miscela per anestesia per l'iniezione intraperitoneale mescolando 0,45 ml di medetomidina cloridrato, 1,2 ml di midazolam e 1,5 ml di tartrato di butorfanolo in 11,8 ml di soluzione fisiologica normale.

2. Preparazione di cellule di microglia umana derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSMG)

NOTA: l'iPSMG (Table of Materials) congelato è stato mantenuto a -80 °C fino all'uso.

1. Scongelare rapidamente le cellule congelate in un bagno d'acqua a 37 °C. Agitare i campioni fino a quando tutto il ghiaccio visibile non si è sciolto.
2. Aggiungere la microglia umana derivata da cellule staminali pluripotenti indotte scongelate (iPSMG) al terreno di coltura riscaldato a 37 °C. Aggiungere 1 mL di cellule scongelate contenenti terreno (1 × 10⁶ cellule) a 10 mL di terreno di coltura.
3. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 minuti per ottenere un pellet di cellule.
4. Dopo la centrifugazione, rimuovere tutto il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. La rimozione completa del surnatante è auspicabile per ridurre la diluizione della concentrazione di citochine nel mezzo di trapianto.
5. Aggiungere il terreno di trapianto per ottenere una concentrazione cellulare di 1 x 10⁵ cellule/μL.
6. Posizionare l'iPSMG sul ghiaccio e procedere immediatamente al trapianto.
   NOTA: La preparazione di iPSMG per il trapianto viene eseguita su un banco pulito per evitare contaminazioni.

3. Preparazione del topo per il trapianto transnasale (Tsn)

1. Nutrire i topi maschi wild-type (C57BL/6J, 8 settimane) con una dieta contenente PLX5622 per 7 giorni.
2. Alla fine del 7^° giorno, interrompere la dieta PLX e nutrire i topi con una dieta normale fino alla fine dello studio.
   NOTA: PLX5622 dieta contenente viene preparata aggiungendo 1,2 g di PLX5622 in 1 kg di AIN-93G (Tabella dei materiali).

4. Trapianto transnasale di cellule

1. 24 ore dopo l'interruzione dell'alimentazione con PLX, pesare i topi e anestetizzarli utilizzando un'iniezione intraperitoneale della miscela di anestesia (0,2 ml/20 g).
2. Dopo che i topi sono stati completamente anestetizzati, come valutato dalla mancata risposta al riflesso di ritiro del pedale (pizzicamento deciso del dito), somministrare 2,5 μL di ialuronidasi in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (100 U/mL), 1 ora prima del trapianto transnasale di iPSMG in ciascuna narice due volte utilizzando una punta di pipetta da 10 μL per aumentare la permeabilità della mucosa nasale.
3. Dopo l'applicazione della ialuronidasi, posizionare i topi in posizione supina.
4. Ripetere il passaggio 4.2 10 minuti prima del trapianto transnasale di iPSMG.
5. Applicare 2,5 μl di sospensione cellulare in una narice del topo utilizzando un puntale per pipetta da 10 μl.
6. Posizionare il topo in posizione supina per 5 minuti prima di somministrare la sospensione cellulare all'altra narice.
7. Ripetere i passaggi 4.5 e 4.6 quattro volte, applicando un volume totale di 20 μl per animale.
8. Posizionare il mouse in posizione supina su un termoforo a 37 °C fino al recupero dall'anestesia.
9. A 48 ore dopo l'interruzione dell'alimentazione con PLX, ripetere nuovamente i passaggi 4.1-4.7 sugli stessi topi.
   NOTA: Va notato che le cellule iPSMG vengono poste su ghiaccio durante il trapianto.

5. Applicazione di citochine

1. Anestetizzare i topi mediante un'iniezione intraperitoneale di una miscela di anestesia (0,2 ml/20 g).
2. Applicare 2,5 μl del mezzo di trapianto in una narice del topo utilizzando un puntale per pipetta da 10 μl.
3. Posizionare il mouse in posizione supina per 5 minuti prima di somministrare il terreno di trapianto all'altra narice.
4. Ripetere i passaggi 5.2 e 5.3 quattro volte, applicando un volume totale di 20 μl per animale.
   NOTA: Va notato che la somministrazione transnasale di terreno di trapianto (citochine umane) è necessaria ogni 12 ore per la vitalità dell'iPSMG trapiantato fino alla fine dello studio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	10566
AIN 93G	Oriental Yeast Co
Siero fetale bovino	GE Healthcare Life Sciences	SH30070.03
Frozen iPSMG	Shionogi & Co., Ltd		Laboratorio per la scoperta di farmaci e la ricerca sulle malattie
Fattore stimolante le colonie umane 1 (hCSF1)	PeproTech	300-25
Ialuronidasi	Sigma-Aldrich	H-3506
Medetomidina cloridrato	Meiji Seika	VETLI5
Midazolam	Astellas	18005A2
Paraformaldeide	Wako Pure Chemical Industries	162-16065
Penicillina/streptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Pipetta	Eppendorf	3120000011
Puntale per pipetta	Eppendorf	30076028
PLX5622	Amadis Chemical	A930097
Fattore di crescita trasformante-β1 (Tgf-b1)	PeproTech	100-21