Imaging dei tessuti profondi del cervello di un pesce zebra utilizzando un microscopio a fluorescenza a tre fotoni

Abstract

Fonte: Hontani, Y., et al. Microscopia a fluorescenza a tre fotoni dei tessuti profondi nel cervello intatto di topo e pesce zebra. J. Vis. Exp. (2022)

Questo video mostra la configurazione e l'esecuzione dell'imaging a tre fotoni in un cervello di pesce zebra anestetizzato. Il protocollo consente la visualizzazione dei tessuti profondi di neuroni marcati in fluorescenza, rivelando l'attività neuronale e le strutture in tempo reale per le applicazioni di ricerca nelle neuroscienze.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Imaging intravitale nel cervello del pesce zebra
   NOTA: Per localizzare correttamente il cervello del pesce sotto la lente dell'obiettivo, viene utilizzata una fotocamera CCD (Charge-Coupled Device) secondaria sullo stesso percorso della luce di eccitazione per l'imaging a campo largo.
   
   1. Imposta il microscopio e calibra la potenza.
   2. Posizionare un obiettivo a basso ingrandimento (in genere 4x) sul microscopio.
   3. Posizionare la capsula di Petri contenente il pesce e i tubi sotto il microscopio.
   4. Utilizzare una sorgente luminosa a diodi emettitori di luce (LED) per illuminare la capsula di Petri.
   5. Aprire la modalità Fotocamera del software di acquisizione immagini (Figura 1).
   6. Fai clic su Live.
   7. Scegli il canale A sul lato destro dello schermo.
   8. Regola le impostazioni dell'istogramma per vedere chiaramente l'immagine.
      NOTA: Questi devono essere aggiornati secondo necessità.
   9. Impostare l'impostazione del motore sul controller del motore su Base.
   10. Abbassare l'obiettivo finché il pesce non è visibile.
       NOTA: Assicurarsi che la lente dell'obiettivo non entri in contatto fisico con la testa.
   11. Posiziona il centro della testa del pesce al centro del campo visivo.
   12. Sposta l'obiettivo verso l'alto e lontano dalla testa del pesce.
   13. Sostituire la lente dell'obiettivo a basso ingrandimento con la lente dell'obiettivo ad alta apertura numerica (NA) per 3PM (microscopia a tre fotoni).
       NOTA: La lente a basso ingrandimento e la lente dell'obiettivo ad alta NA non devono essere parafocali, ma devono essere abbastanza vicine da garantire che il pesce si trovi all'interno del campo visivo della lente dell'obiettivo ad alta NA.
   14. Abbassare lentamente la lente dell'obiettivo, assicurandosi che l'obiettivo non entri in contatto fisico con la testa. Nel software della telecamera CCD, interrompere lo spostamento dell'obiettivo quando la parte superiore della testa è visibile. Impostare la posizione z su 0 μm.
       NOTA: Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria sotto la lente dell'obiettivo quando si utilizza un obiettivo a immersione in acqua.
   15. Spegnere la sorgente luminosa a LED e chiudere la tenda scura attorno al sistema.
   16. Impostare il software di acquisizione delle immagini sulla modalità Multiphoton GG per l'imaging 3P e impostare la potenza sotto la lente dell'obiettivo su meno di 1 mW (con frequenza di ripetizione degli impulsi di ~1 MHz).
   17. Modificare il pulsante di impostazione del motore da Base a Obiettivo sul controller del motore.
   18. Abbassa le luci nella stanza.
   19. Accendere i tubi fotomoltiplicatori (PMT) e aprire l'otturatore della sorgente di eccitazione 3PM. Assicurarsi che un contorno dell'osso appaia nel canale del segnale di fluorescenza a causa dell'autofluorescenza e nel canale del segnale di terza armonica (THG) a causa del THG dell'osso (Figura 1C).
   20. Esegui l'imaging a diverse profondità aumentando i livelli di potenza quando si esegue l'imaging più in profondità.

Results

Figura 1: Schermate rappresentative per l'imaging intravitale nei pesci (sezione protocollo 1). (A) Visualizzazione in modalità telecamera del software di acquisizione delle immagini con obiettivo 4x inserito. Le caratter...

Materials