Imaging della migrazione delle cellule tumorali nel tessuto del glioblastoma mediante microscopia confocale a scansione time-lapse

Abstract

Fonte: Parker, J. J., et al. Un modello di coltura a fette organotipiche di glioblastoma umano per lo studio della migrazione delle cellule tumorali e degli effetti specifici del paziente dei farmaci anti-invasivi. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra l'imaging di fette di tessuto di glioblastoma che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) tramite microscopia confocale. Le immagini ad alta risoluzione vengono acquisite a intervalli coerenti per tracciare il movimento e la direzione delle cellule tumorali.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Marcatura delle cellule tumorali tramite retrovirus fluorescente verde che esprime proteine

NOTA: La microscopia time-lapse per l'analisi della migrazione delle cellule tumorali richiede una marcatura fluorescente stabile e a lungo termine delle cellule all'interno della coltura a fette. L'uso del retrovirus è suggerito perché infetta selettivamente le cellule in divisione, arricchendo così la marcatura fluorescente all'interno della popolazione di cellule tumorali rispetto alla microglia o ad altri tipi di cellule presenti all'interno della fetta. La standardizzazione dell'infezione suggerisce che un titolo virale di^10-4 CFU/μL determina un'espressione proteica fluorescente verde sufficiente per il tracciamento e l'analisi della migrazione cellulare. L'aumento del titolo virale, l'uso di virus non selettivi (ad es. adenovirus, lentivirus) o altri mezzi di marcatura di tutte le cellule possono precludere l'identificazione di confini cellulari chiari durante la migrazione, complicando così l'analisi. L'uso di marcatori fluorescenti alternativi può essere utilizzato e ottimizzato secondo necessità.

1. Ottenere il retrovirus per l'infezione delle fette tumorali tramite protocolli standard5,14 o da una fonte disponibile in commercio. Diluire il surnatante virale aggiungendo il volume appropriato in un mezzo neuronale non integrato per ottenere un titolo virale di 10-4 CFU (unità formanti colonie) /μL.
2. Tra 7 e 10 giorni di coltura, infettare le colture di fette tumorali di interesse con 5 - 10 μL di virus (10,⁴ CFU/μL). Posizionare delicatamente il virus goccia a goccia sulla superficie di ogni fetta di tessuto. Diminuire il volume del surnatante aggiunto se la fetta galleggia sulla superficie dell'inserto. Trasferire le piastre contenenti le colture di fette in un'incubatrice.
3. Valutare le fette per le cellule tumorali marcate a partire da 24 ore dopo l'infezione virale. Questo ritardo varierà a seconda dell'incorporazione virale e della cinetica di espressione genica della fluorescenza. Per i costrutti virali utilizzati qui, sono state necessarie 72 ore per osservare un robusto segnale fluorescente con un microscopio a epifluorescenza standard.
   NOTA: Raramente, le fette mostrano una distribuzione prevalentemente periferica di cellule marcate viralmente, che può complicare l'imaging confocale. Per evitare questa complicazione, cercare di ridurre lo spessore della fetta e la variazione di spessore tra la fetta. Se la coltura a fette ha una regione più spessa vicino al centro, ciò può impedire un'adeguata penetrazione dei nutrienti, limitando così la popolazione di cellule tumorali in divisione attiva. Un test qualitativo per lo screening di questa complicanza è l'aggiunta di un reagente colorante tetrazolio (cioè MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro)) al terreno di coltura a fette. Le aree della fetta che non diventano blu dopo l'aggiunta del reagente indicano una mancanza di attività metabolica e una salute compromessa della fetta.

2. Imaging confocale a scansione laser a fotone singolo time-lapse della migrazione delle cellule tumorali

NOTA: Dopo che la trasduzione riuscita e la salute della coltura sono state confermate, le cellule possono essere visualizzate in condizioni di controllo, seguite da un periodo uguale di imaging in condizioni di trattamento. Utilizzando questo protocollo, le cellule sono state analizzate e monitorate con successo per 12 ore in ciascuna condizione. Tuttavia, anche periodi più brevi o più lunghi di imaging e manipolazione ambientale possono essere informativi.

1. Caricamento del microscopio
   1. Prima dell'imaging, metti 1 ml di terreno di coltura fresco in un piatto con fondo di vetro.
   2. Lasciare equilibrare il terreno nel piatto con fondo di vetro in un incubatore per 15 min.
      NOTA: A questo punto gli agenti di marcatura solubili, come le lectine coniugate fluorescenti (ad es. lectina IB4 per la marcatura delle microglia) o i punti quantici coniugati con ligando, possono essere aggiunti al terreno di coltura della fetta per l'identificazione delle sottopopolazioni cellulari durante l'imaging.
   3. Trasferire l'inserto da visualizzare in una piastra con fondo di vetro utilizzando una pinza sterile in una cappa a flusso laminare. Trasportare la capsula al tavolino del microscopio.
   4. Mantenere le colture a fette a 37 °C e al 5% di CO₂ in un incubatore da tavolo sigillato per microscopio. Utilizzare l'umidificazione sterile H₂O della camera di incubazione, se disponibile, per evitare un'eccessiva evaporazione del terreno (particolarmente importante per gli esperimenti di imaging più lunghi).
   5. Utilizza un microscopio confocale con un obiettivo ad aria 10X a lunga distanza di lavoro ed eccitazione laser per fotone singolo e/o multifotone. nota: Assicurarsi che la lente dell'obiettivo del microscopio fornisca una distanza di lavoro adeguata. Grazie all'altezza aggiuntiva dell'incubatore sul palco, del piatto con fondo in vetro e dell'inserto per colture tissutali, gli obiettivi a lunga distanza di lavoro sono fondamentali.
   6. Fissare la piastra inferiore in vetro, rimuovere il coperchio in plastica della capsula di Petri e coprire con una membrana permeabile ai gas.
2. Acquisizione immagini
   1. Usa il microscopio per ispezionare visivamente la fetta e individua un campo adatto con un'adeguata densità di cellule tumorali marcate in modo fluorescente tra il bordo della fetta e il centro. Evitare i campi di imaging sul bordo della fetta, a causa della maggiore suscettibilità degli spostamenti dei tessuti durante l'imaging. Le arpe a fette di tessuto possono essere impiegate per limitare questo spostamento.
   2. Utilizzare il software di imaging in modalità di analisi multidimensionale per impostare il primo (in basso) e l'ultimo (in alto) confini dello Z-stack, in modo tale che tutte le posizioni da riprendere contengano un segnale cellulare fluorescente visibile. L'imaging attraverso 150 - 200 μm della fetta, con un passo Z costante di 10 μm, ha fornito una risoluzione adeguata per il tracciamento dei percorsi cellulari (che può essere regolata in base alle esigenze di imaging individuali).
   3. Se il microscopio è dotato di un tavolino motorizzato, assicurarsi che sia concesso un tempo adeguato per ogni acquisizione Z-stack. Impostare l'intervallo di tempo tra le acquisizioni in modo che sia uguale al tempo di scansione per posizione x al numero di posizioni per l'immagine (ad esempio, le regioni tumorali visualizzate).
      NOTA: Per l'eccitazione simultanea dei fluorofori verdi e rossi, utilizzare un programma di scansione laser a doppia linea, con eccitazione simultanea di 488 nm e 633 nm. La lunghezza d'onda dell'eccitazione laser selezionata varierà in base alle singole proteine fluorescenti espresse.
   4. Mantenere uniformi la potenza del laser e le impostazioni del foro stenopeico confocale tra le regioni tumorali visualizzate. Utilizza l'impostazione di potenza laser più bassa necessaria per demarcare chiaramente i corpi e i processi delle cellule tumorali per limitare la fototossicità. Le unità di parametri di imaging specifiche (ad es. potenza e impostazioni del foro stenopeico confocale) variano in base alle specifiche del microscopio e della sorgente laser.
   5. Compensa la potenziale evaporazione del fluido aggiungendo 2 - 3 passi Z-stack "tampone" nei piani focali che avanzano verso l'obiettivo. Ciò impedisce efficacemente al tessuto di uscire dall'intervallo di acquisizioni Z-stack sul piano verticale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM High Glucose	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A Medium, meno rosso fenolo	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 Supplement (50X), siero libero	Invitrogen (Gibco)	17504-044
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	Invitrogen (Gibco)	15140-122
GlutaMAX Integratore	Invitrogen (Gibco)	35050-061
L-Glutammina (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
HEPES (1 M)	Invitrogen (Gibco)	15630-080
Nistatina Sospensione	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	10.000 unità/mL in DPBS, trattato asetticamente, BioReagent, adatto per colture cellulari
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen (Gibco)	16520-050	Fonde a 65,5 C, rimane fluido a 37 C e si fissa rapidamente al di sotto dei 25 C.
Isolectin GS-IB4 da Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Coniugato	Thermo Fisher (Molecular Probes)	I32450	Utilizzato nei terreni per marcare Microglia/Macrofagi
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector	Clonetech	632520
Concentratore Retro-X	Clonetech	31455	Resina legante per la concentrazione non ultracentrifugante di surnatanti virali
pVSG-G Vector	Clonetech	631530	parte del sistema di espressione retrovirale universale Retro-X
GP2-293 Celle di imballaggio virale	Clonetech	631530	parte del sistema di espressione retrovirale universale Retro-X
Colla cianoacrilica (super colla)	Sigma-Aldrich	Z105899
inclusione Peel-A-Way a media viscosità (quadrato - S22)	Polysciences, Inc.	18646A-1	Stampi per l'inclusione di campioni tumorali
Micro spatole in acciaio inossidabile	Fisher Scientific	S50823	Strumento di curvatura a 45 gradi sul collo della lama del cucchiaio
Pinze curve Fisherbrand per dissezione a punta fine	Fisher Scientific	08-875
Lama di rasoio a taglio singolo (rasoi di sicurezza americani)	Fisher Scientific	17-989-001	Il bordo della lama ha uno spessore di 0,009 pollici. Il coperchio crimpato con bordo smussato viene rimosso prima di caricarlo sul vibratome.
Leica VT1000 S Vibratomo	Leica Biosystems	VT1000 S
Inserto per colture cellulari in PTFE idrofilo	EMD Millipore	PICM0RG50	30 mm, PTFE idrofilo, dimensione dei pori 0,4 μm
35 mm Piatti con fondo in vetro	MatTek	P35G-1,5-20-C Manicotto	diametro vetro 20 mm. Vetrino coprioggetti spessore 1,5
LSM 510 Micoscopio confocale	Zeiss	LSM 510	10x Obiettivo ad aria (c-Apochromat NA 0,45)
Incubatore da palcoscenico PECON	Germany	(Fuori produzione)	L'incubatore PM 2000 RBT è un prodotto comprabile progettato per l'uso con i microscopi Zeiss.

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