Imaging spontaneo del calcio per la dinamica compartimentale specifica negli astrociti

In questo articolo

Abstract

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Fonte: Bannai, H., et. al., Dissezione dei segnali locali di Ca2+ in cellule coltivate mediante indicatori di Ca2+ mirati alla membrana. J. Vis. Exp. (2019)

Il video mostra l'imaging a fluorescenza per osservare la dinamica spontanea del calcio specifica del compartimento negli astrociti, monitorando in sequenza le proteine sensibili al calcio localizzate sulla membrana plasmatica e sul reticolo endoplasmatico.

Protocollo

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1. Imaging del Ca²⁺

Registrazione delle attività spontanee degli astrociti che esprimono Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f/
NOTA: Senza ottiche che dividono l'immagine, i segnali del Ca²⁺ sulla membrana plasmatica e quelli intorno al reticolo endoplasmatico (ER) possono essere monitorati nella stessa cellula. Qui, viene descritta la registrazione sequenziale di Lck-RCaMP2 (Plasma-membrane-targeted genetically encoded Ca²⁺ indicator) e OER-GCaMP6f (Outer endoplasmic reticulum membrane-targeted genetically encoded Ca²⁺ indicator) negli stessi astrociti. Un obiettivo a immersione in olio con un'apertura numerica superiore a 1,3 è altamente raccomandato per l'attività spontanea del Ca²⁺.
1. Accendi il microscopio, la fotocamera, la fonte di luce e la camera di riscaldamento del microscopio per almeno 30 minuti prima di registrare.
2. Montare il vetrino coprioggetti contenente le cellule trasfettate con Lck-RCaMP2 e OER-GCaMP6f nella camera di registrazione e aggiungere 400 μl del mezzo di imaging. Metti un coperchio sopra la camera.
3. Scegliere il set di filtri per GCaMP6f e la sorgente luminosa (luce di eccitazione blu, ad es. 470-490 nm; vedere la tabella dei materiali). Localizzare gli astrociti che esprimono OER-GCaMP6f.
4. Scegliere un set di filtri e la sorgente luminosa per RCaMP2 (luce di eccitazione verde, ad es. 510-560 nm; vedere la Tabella dei materiali) e confermare se Lck-RCaMP2 è espresso negli stessi astrociti. Evitare l'esposizione prolungata alla fonte di luce per evitare il fotosbiancamento.
5. Registra immagini time-lapse di Lck-RCaMP2 a 2 Hz per 2 minuti. Salva i dati di imaging sull'HDD.
6. Cambia il set di filtri con quello per GCaMP6f. Registra immagini time-lapse di OER-GCaMP6f nello stesso campo visivo a 2 Hz per 2 minuti. Salvare i dati sull'HDD.
7. Analizza i dati utilizzando il software di analisi delle immagini.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
18-mm di diametro coprioggetti circolari	Karl Hecht "Assistent"	#41001118	Spessore 1, vetrini coprioggetti circolari di 18 mm di diametro; possono essere utilizzati vetrini coprioggetti alternativi.
Telecamera per la registrazione			Erano disponibili per l'uso le seguenti telecamere: telecamera CCD raffreddata (ad es. Hamamatsu Photonics, OECA-ER), telecamera EM-CCD (ad es. Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) o fotocamera CMOS (ad esempio, Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
		analisi delle immagini	come Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH) e TI Workbench14 (su misura)
Mezzo di imaging e tampone			Utilizzare un mezzo o un tampone ottimale per l'esperimento. Quando si utilizza un terreno, è preferibile un terreno senza rosso fenolo per ridurre la fluorescenza di fondo. Aggiungere 20 mM di HEPES per mantenere il pH al di fuori dell'incubatore ad anidride carbonica.
		fluorescenza invertita	come IX73 (Olympus) o Eclipse TI (Nikon Instech)
Set di filtri per microscopio per imaging			Filtro appropriato per GFP (eccitazione, 480 ± 10 nm; emissione, 530 ± 20 nm)
Set di filtri per microscopio per imaging			Filtro appropriato per RFP (eccitazione, 535 ± 50 nm; emissione, 590 nm passaggio lungo)
		di riscaldamento del microscopio	Un sistema di riscaldamento per mantenere le cellule a 37°C durante l'imaging. Per evitare derive causate dall'espansione termica, si consigliano sistemi di riscaldamento che coprano l'intero microscopio stesso (ad esempio, Tokai Hit, Thermobox).
Sorgente luminosa per microscopio per eccitazione			Lampada al mercurio (100 W), lampada allo xeno (75 W), sistema di illuminazione a diodi emettitori di luce (LED) (ad es. CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., sorgente LED a 4 lunghezze d'onda; Lumencor, motore luminoso SPECTRA X). In caso di grumi di mercurio e lampade allo xeno, utilizzare il filtro ND per ridurre l'intensità di eccitazione.
L'obiettivo			immersione in olio Plan-Apochromat con apertura numerica superiore a 1,3 è altamente raccomandato per la registrazione dell'attività spontanea del Ca²⁺ nei neuroni e negli astrociti.
Camera di registrazione	Elveflow	Ludin Chamber	Questa camera di registrazione è per vetrini coprioggetti rotondi da 18 mm di diametro.
Stereomicroscopio			Utilizzato per sezionare gli ippocampi. Sono disponibili stereomicroscopi Olympus SZ60 o equivalenti.

di immagini microscopiche Software di Microscopio a GCaMP6f RCaMP2 Sistema a

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