Descriviamo un protocollo di microscopia brightfield intravitale per la misurazione dinamica dei neutrofili, le interazioni delle cellule endoteliali durante il reclutamento dei neutrofili in risposta alla sorgente di un fattore chemiotattico dei neutrofili in vivo. Crawling dei neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale nel tessuto muscolare del mouse cremastere vengono visualizzati con il tempo trascorso fotografia-video e monitorati con ImageJ.
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Articolo metodologico
Monitoraggio Crawling neutrofili intraluminale, migrazione e chemiotassi transendoteliale in tessuto al microscopio video intravitale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il reclutamento dei leucociti circolanti dal flusso di sangue al tessuto infiammato è un processo cruciale e complesso di 1,2 infiammazione. Nel venule postcapillari di tessuto infiammato, leucociti inizialmente laccio e rotolare sulla superficie luminale di venulare muro. Rotolamento arresto leucociti sull'endotelio e sottoposti ferma adesione in risposta alle chemochine o altri fattori chemiotattici sulla superficie venulare. Molti leucociti aderenti trasferirsi dal sito iniziale di adesione al sito di stravaso giunzionale in endotelio, un processo chiamato intraluminale strisciare 3. A seguito di scansione, leucociti si muovono attraverso endotelio (trasmigrazione) e la migrazione nel tessuto extravascolare verso la sorgente di chemiotattico (chemiotassi) 4. Microscopia intravitale è un potente strumento per la visualizzazione delle interazioni leucociti-endotelio delle cellule in vivo e rivelando i meccanismi cellulari e molecolari del reclutamento dei leucociti 2,5. In questo rapporto, forniamo una descrizione completa della usando la microscopia intravitale brightfield di visualizzare e determinare i processi di reclutamento dei neutrofili dettagliato nel muscolo cremastere topo in risposta al gradiente di un fattore chemiotattico dei neutrofili. Per indurre il reclutamento dei neutrofili, un piccolo pezzo di gel (~ 1-mm 3 dimensioni) contenente chemoattractant neutrofili MIP-2 (CXCL2, una chemochina CXC) o WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, un analogo sintetico di peptide batterica) è posizionato sul tessuto muscolare adiacente al venule osservato postcapillari. Con il tempo trascorso fotografia-video e computer software ImageJ, strisciando neutrofili intraluminale sull'endotelio, transendoteliale migrazione dei neutrofili e la migrazione e chemiotassi nei tessuti sono visualizzati e monitorati. Questo protocollo permette un'analisi attendibile e quantitativa di numerosi parametri di reclutamento dei neutrofili, come la velocità strisciare intraluminale, tempo di trasmigrazione, il tempo di distacco, la velocità di migrazione, la velocità e l'indice chemiotassi chemiotassi nei tessuti. Abbiamo dimostrato che l'utilizzo di questo protocollo, questi parametri reclutamento dei neutrofili può essere determinato in modo stabile e la locomozione singola cella comodamente rintracciato in vivo.
Protocollo
1. Preparazione del chemiotattico in gel
- Pipettare 10 ml di 2 × PBS in un tubo da 50 ml conica, e scaldare il tubo mettendolo in un bicchiere contenente acqua calda.
- Pipettare 10 ml di acqua distillata e aggiungere 0,4 g di polvere di agarosio in un altro tubo da 50 ml coniche (con il suo tappo leggermente allentato) e scaldare la miscela fino a poco bollente in un forno a microonde (per ~ 1 minuto in un 700-watt forno a microonde) .
- Aggiungere il riscaldato 2 × PBS alla soluzione di agarosio tubo, agitare la soluzione mista e tenerlo caldo nel bicchiere di acqua calda.
- Micropipetta soluzione chemiotattico (ad esempio, 10 ml d....
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Discussione
Microscopia intravitale è lo strumento essenziale per rivelare i meccanismi cellulari e molecolari del reclutamento dei leucociti durante l'infiammazione. Visualizzazione quantitativa per la determinazione delle interazioni leucociti-endotelio cellula microcircolo dei tessuti traslucida come il muscolo cremastere e mesentere rimane il gold standard per l'applicazione della tecnica di 1,5. La microscopia convenzionale intravitale brightfield ha molte caratteristiche uniche tecniche e dei meccanismi di .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di ricerca dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR, MOP-86749). L. Liu è un destinatario di CIHR New Investigator Award (MSH-95374).
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Materiali
Tabella: Materiali, reagenti e attrezzature specifiche
| Nome del reagente / attrezzature | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Tubi in polietilene, PE10 | Becton Dickinson | 427401 | ID 0,28 millimetri x 0,61 millimetri OD |
| China | Speedball Art | Super Black | Pigmento-no di carbonio nero al 100% coloranti |
| Cauterio | Aaron medici | AA03 | |
| Xylazina | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Cloridrato di ketamina | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Murina ricombinante MIP-2 | R & D Systems | 452-M2 | |
| WKYMVm | Phoenix Pharmaceuticals, Inc. | 072-12 | |
| Agarosio | Invitrogen | 15510-027 | Ultrapura |
| Eparina | Sigma | H-3393 | |
| Microscopio in posizione verticale | Olimpo | BX61WI | |
| 3CCD telecamera a colori | SONY | DXC-990 | |
| HD-DVD videoregistratore | LG Electronics Inc. | RH398H-M | |
| Monitor TV | LG Electronics Inc. | 22LG30 | |
| Acqua circolatore | Thermo Scientific | HAAKE DC10 | |
| Pompa peristaltica | Gilson; Pharmacia | Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P-3 | |
| Cremaster muscolare bordo | Università di Saskatchewan | Fatto in casa |
Riferimenti
- Liu, L., Kubes, P. Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action. Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).
- Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective. J. Immunol. ....
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Ristampe e permessi
